Результаты генетических исследований, выполненные с использованием технологии микрочипов, показали что S. aureus принадлежит к гетерогенным видам: до 22 % его генетического материала может являться штаммоспецифичным. В этой связи совершенно очевидно, что успешный мониторинг внутрибольничных стафилококковых инфекций должен основываться на адекватных методах идентификации и внутривидовой дифференциации возбудителя. Эти методы традиционно разделяют на фенотипические и генотипические.

К числу фенотипических методов дифференциации S. aureus относят определение профиля антибиотикорезистентности, фаго- и лизогенотипирование, биотипирование, мультилокусный энзим-электрофорез (MLEE), иммуноблоттинг поверхностных клеточных протеинов. Именно в результате использования этих методов в 50-80-е годы прошлого века сформировалось представление об эпидемическом распространении заболеваний, вызванных S. aureus, в том числе и МRSА. В настоящее время они используются, главным образом, только для первичной характеристики выделенных изолятов и оценки их фенотипического разнообразия.

Низкая чувствительность изолятов MRSA к фагам Международного набора послужила толчком сначала к созданию новых дополнительных коллекций бактериофагов, а в дальнейшем — к бурному развитию молекулярно-генетических технологий типирования S. aureus.

К настоящему времени предложено не менее 20 различных методов, основанных на изучении как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Такое разнообразие методов свидетельствует о том, что ни один из них полностью не удовлетворяет исследователей. Среди молекулярных методов типирования, основанных на изучении полиморфизма структуры всей хромосомы, наибольшее распространение получил анализ хромосомной ДНК S. aureus, использующий расщепление геномной ДНК редкощепящей рестриктазой Smal с последующим разделением образовавшихся фрагментов в пульсирующем электрическом поле (англ. pulsed-field gel electrophoresis — PFGE). Благодаря хорошей дифференцирующей способности метод был признан «золотым стандартом» для типирования стафилококков различных видов, в том числе и штаммов MRSА.

Однако метод не лишен ряда существенных недостатков, среди которых значительная трудоемкость, продолжительность проведения анализа и его дороговизна. Несмотря на значительные усилия, метод не удалось полностью стандартизовать, что затрудняет введение его в качестве единой межлабораторной базы данных типируемых штаммов. Не получили распространения и методы анализа хромосомной ДНК с помощью различных вариантов саузерен-блоттинга из-за сложностей или низкой дифференцирующей способности.

Другая группа методов, основанная на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР), включает типирующие методы, при которых один или несколько хромосомных локусов сначала амплифицируются в ПЦР, а затем анализируются по величине образовавшихся ампликонов, сайтам рестрикции эндонуклеаз или специфичности последовательности нуклеотидов, выявленной с помощью секвенирования. Для этой группы методов критически важным оказался выбор исследуемого генетического маркера. Появившаяся в конце 20-го века возможность секвенировать ДНК явилась мощным инструментом в совершенствовании методов типирования, основанных на ПЦР. Секвенирование имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами, среди которых достаточная скорость, точность и объективность в интерпретации результатов, простота в создании баз данных.

М. С. Maiden et al. в 1998 г. был предложен метод мультилокусного секвенирования, сокращенно обозначаемого MLST (от английского multilocus sequence typing), основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей внутренних фрагментов 7 генов общего метаболизма, т. е. генов, ответственных за поддержание жизнедеятельности микробной клетки; arc, aro, glp, gmk, pta, tpi и yqi. Известные комбинации мутаций в каждом гене описываются как аллельные варианты. Каждый штамм характеризуется набором аллелей этих генов, т. е. аллельным профилем, или сиквенс-типом (ST). Клинические изоляты, несущие мутации в 1-3 генах, формируют в группы, получившие название клональных комплексов (Clonal complex — СС). Впервые была создана международная база данных в Интернет, которая обеспечивает возможность сопоставления аллельных профилей клинических изолятов MRSA, исследуемых в различных лабораториях.

MLST характеризуется меньшей дифференцирующей способностью, чем PFGE, поскольку основан на точечных мутациях в генах, существенных для поддержания жизнедеятельности клетки, и исследует медленно эволюционирующее геномное «ядро». Позднее в MLST-анализ авторы включили секвенирование генов, кодирующих семь поверхностных протеинов. Повысилась дифференцирующая способность метода, но он стал еще более дорогостоящим и громоздким. Следовательно, был необходим поиск и других генетических маркеров, которые могли бы быть использованы как альтернатива мультилокусному секвенированию для типирования MRSA. Данные определения нуклеотидной последовательности некоторых генов S. aureus свидетельствовали о том, что гены, кодирующие коагулазу (соа) и протеин A (spa), а также ряд других генов, кодирующих факторы патогенности (clfA, clfB, sspA, sdrC, sdrD, sdrE), содержат в своем составе вариабельные области, состоящие из коротких тандемных повторов (short sequence repeat — SSR), различия в числе и структуре между которыми могут быть использованы для дифференциации штаммов.

Было обнаружено, что содержащая более короткие повторы вариабельная область гена spa более полиморфна, чем вариабельная область гена соа, и ее секвенирование может быть более эффективно для эпидемиологического расследования вспышек. Позднее было показано, что spa- типирование является адекватным методом и для решения вопросов эпидемиологии стафилококковой инфекции в глобальном масштабе. По своей дифференцирующей способности этот метод опережает мультилокусное секвенирование по 7 генам общего метаболизма и приближается к дифференцирующей способности секвенирования по 14 генам и PFGE. Разработка новой номенклатуры и создание в Интернет базы данных, предпринятое в октябре 2005 года группой немецких исследователей (для справки см. http://www.ridom./spaserver/nomenclature.shtml), делает этот метод еще более универсальным. За последние годы вследствие своей хорошей воспроизводимости, высокой дифференцирующей способности, достаточной дешевизны метод получил широкое распространение. На сентябрь 2011 г. с использованием базы spa-сервера проанализированы 185778 клинических изолятов S. aureus, выделенных в 84 странах мира. База содержит данные о 448 структурных вариантах повторов, которые формируют 9365 spa-типов.

Вместе с тем секвенирование представляет достаточно сложный метод, для применения которого требуется дорогостоящее оборудование и квалифицированный персонал. В связи с этим были предприняты попытки разработки методов типирования, основанных на одновременной ПЦР-амплификации нескольких генетических маркеров, имеющих в своем составе различное число тандемных повторов, или VNTRs (англ. — variable number tandem repeats), с последующим анализом профиля образовавшихся ПЦР-продуктов в гель- электрофорезе. К числу этих методов относятся ряд мультиплексных Г1ЦР, в том числе:

• описанная как MLVA, мультиплексная ПЦР, где анализируются величина ампликонов и рассчитывается число тандемных повторов семи генов, детерминирующих синтез протеинов, связанных с клеточной стенкой и участвующих в процессах адгезии и инвазии;

• ПЦР-ПДРФ повторяющихся элементов STAR;

• метод SIRU (staphylococcal interspersed repeat units), при котором анализируются рассеянные по геному тандемные повторяющиеся последовательности, большинство из которых находится в некодирующих областях.

Предпринята и попытка создания автоматизированной системы, основанной на исследовании VNTRs 9 генов, а также определении гена tec А. В настоящее время эти методы используются в основном лишь для расшифровки локальных вспышек.

В дополнение к PFGE, MLST и spa-типированию нередко используют идентификацию кассет tec, детерминирующих устойчивость к бета-лактамным антибиотикам. Этот вид типирования получил название SCCtec-типирования. Многие исследователи для дифференциации штаммов S. aureus дополнительно проводят определение профиля генов токсигенности, большинство из которых присутствует в геноме в составе мобильных генетических элементов, а также исследуют полиморфизм структуры ряда регуляторных генов.

Для дифференциации клинических изолятов S. epidermidis, наряду с PFGE, используют мультилокусное секвенирование и SCCtec-типирование. Оригинальные схемы мультилокусного секвенирования предложены для S. haemolyticus и некоторых коагулазоположительных видов стафилококка, выделенных от животных.

- Читать далее "Экспериментальные модели стафилококковой инфекции"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 10.3.2020