Для оценки состояния клеточного звена иммунной системы определяют:
— общее количество клеток системы иммунитета;
— функциональную активность клеток по способности поглощать и переваривать микроорганизмы, вырабатывать цитокины, бактерицидные метаболиты кислорода и др.

Для установления общего количества клеток проводят анализ лейкоцитарной формулы на основании общеклинического анализа крови по гематологическим параметрам (в абсолютном и относительном значении), подсчет числа В- и Т-лимфоцитов в периферической крови. Оценку Т- и В-систем иммунитета проводят, используя метод определения на поверхности лимфоцитов дифференцировочных антигенов (CD-кластеров). Эти антигены могут быть определены методами розеткообразования с использованием эритроцитов животных разных видов или при помощи моноклональных антител, меченных флюорохромами. Обработанные флюоресцирующими антителами клетки подсчитывают визуально в ЛЮМе или в автоматическом проточном цитофлюориметре.

Техника подсчета основных популяций лимфоцитов методом иммунофлюоресценции. Предварительно проводят выделение и обработку лимфоцитов меченными флюорохромами моноклональными антителами, соблюдая следующие этапы:

• лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови на фиколл-верографиновом(урографиповом)растворевградиентеплотности 1,077 г/мл путем центрифугирования в течение 30 мин при 1500 об/мин. Лимфоидные клетки образуют кольцо на поверхности градиентной смеси, их переносят в отдельную пробирку и двукратно отмывают раствором Хенкса;

• в камере Горяева посчитывают количество отмытых лимфоцитов (их должно быть не менее 3000 кл/мкл). Взвесь клеток вносят по 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для иммунологических реакций. Количество лунок определяют по количеству используемых моноклональных антител против CD-кластеров лимфоцитов;

• к осевшим лимфоцитам добавляют по 20 мкл моноклональных антител (иммуноглобулины мыши). Инкубируют 35-40 мин при 4 °С. Затем во все лунки добавляют по 150 мкл раствора Хенкса, центрифугируют 5 мин при 200 об/мин, супернатант удаляют. Отмывание центрифугированием повторяют трижды;

• к осадку отмытых лимфоцитов добавляют по 20 мкл ФИТЦ-меченных овечьих антител к иммуноглобулинам мыши (ФИТЦ-конъюгат), для разведения которого используют раствор Хенкса с 0,1% натрия азидом. Клетки ресуспендируют и инкубируют 30 мин при 4°С;

• проводят двукратное отмывание лимфоцитов центрифугированием, как описано выше. Затем клетки из каждой лунки переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом. и исследуют в ЛЮМе с иммерсионным маслом. Посчитывают абсолютное (кл/мкл) и относительное (%) количество лимфоцитов. На каждые 200 лимфоцитов определяют количество светящихся клеток.

Если подсчет клеток будет производиться спустя какое-то время, необходимо их зафиксировать. Для этого к осадку отмытых лимфоцитов добавляют 50 мкл 1% раствора параформальдегида на ФСБ. Такие фиксированные клетки сохраняют флюоресценцию в течение недели.

Выделенные и обработанные вышеописанным методом лимфоциты могут быть использованы для автоматического подсчета на проточном цитофлюориметре в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Определяют количественное содержание лимфоцитов (всего, отдельно В- и Т-лимфоцитов), численность различных субпопуляций' (Т-хелперов, Т-супрессоров) лимфоцитов и др..

Принцип метода состоит в следующем. Меченные флюоресцирующими антителами лимфоциты пропускают через тонкую трубочку, в которой они разбиваются в капли. Если капля содержит 1 меченую клетку, лазерный луч отклоняется и возбуждает свечение флюорохрома в молекуле антитела. Чувствительный фотодетектор улавливает сигналы, которые подаются на компьютер для обработки.

- Вернуться в оглавление раздела "Медицинская микробиология"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.08.2019