а) Таксономия. Впервые клебсиеллы обнаружил германский исследователь Edwin Klebs в 1875 г. при патоморфологическом изучении материалов, полученных при аутопсии умершего от крупозного воспаления легких. Однако ученому не удалось выделить чистую культуру микроорганизма и только в 1882 г. F. Friedlander получил чистую культуру возбудителя пневмонии и подробно описал выделенные им капсульные бактерии, получившие название палочки Фридлендера.

Как известно, бактерии рода Klebsiella входят в состав семейства Enterobacteriaceae и относятся к группе факультативных представителей нормальной микрофлоры человека и животных, а также способных вызывать развитие оппортунистических инфекций. Ранее род Klebsiella включал два вида: К. pneumoniae с подвидами pneumoniae, ozaenae, rhinoscleromatis и К. oxytoca. Бактерии вида К. aerogenes, отличающиеся от других представителей рода Klebsiella по подвижности (наличию жгутиков) и ряду других фенотипических и генотипических свойств, отнесены к виду Enterobacter aerogenes. Предлагаемое некоторыми исследователями обозначение Klebsiella mobilis Международной Юридической Комиссией по таксономии микроорганизмов не было принято. В начале 90-х годов из объектов окружающей среды впервые были выделены бактерии К. planticola и К. tenigena.

Последние обитают в воде и почве, образуют капсулу, от бактерий К. pneumoniae отличаются способностью расти при температуре 10°С, неспособностью образовывать газ из лактозы при 44,5°С и способностью ферментировать мелицитозу. К. planticola, в отличие от К. tenigena, не способны ферментировать мелицитозу. Различия фенотипических и генотипических свойств позволили включить эти два вида в состав рода Klebsiella [IX издание Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1994]. В 2001 году на основании анализа последовательностей генов 16S рРНК и фоВ бактерии К. planticola и К. terrigena выделены в состав нового рода Raoultella с сохранением их видового обозначения: Raoultella planticola spp. nov. и Raoultella terrigena spp. nov.

В 2004 году при секвенировании геномов и анализе нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, rpoB, gyrA, mdh, infB, phoE и nifH предложено дополнительно отнести в роду Klebsiella пять новых видов: К. omithinolytica, К. variicola, К. singaporensis, К. milletis и К. senegalensis, обнаруживаемых во внешней среде. Следует отметить, что бактерии двух видов: К. pneumoniae и К. oxytoca наиболее часто обнаруживают при гнойно-воспалительных процессах различной локализации, в том числе при воспалительных процессах носа и носоглотки, гнойном среднем отите и гнойном перикардите. В то же время эти бактерии встречаются в кишечном тракте человека и животных и могут быть выделены при бактериологическом исследовании водоемов и растений.

До последнего времени считали, что представители рода Raoultella не имеют значения для медицинской бактериологии. Однако в источниках литературы появляются сведения о выделении сапрофитических R. terrigena и R. planticola из клинического материала и обсуждается вопрос об их патогенности для людей. Исследования, проведенные во Франции и Германии, показали, что в 19% случаев клинические штаммы, выделенные от взрослых, принадлежат к виду R. planticola, частота которых среди штаммов клебсиелл, выделенных от новорожденных, составляет 8,7 % случаев.

б) Морфология. Клебсиеллы представляют собой прямые неподвижные грамотрицательные палочки размерами (0.6-6.0) х (0.3-1.0) мкм. В мазках бактериальные клетки расположены одиночно, парами или короткими цепочками. Обычно имеют выраженную капсулу. Клетки клебсиелл неровной овальной формы, спор не образуют. Для К. pneumoniae и К. oxytoca характерна массивная полисахаридная капсула, определяющая формирование крупных мукоидных колоний. На ультратонком срезе вокруг клеток клебсиелл видна мощная капсула.

Капсулы обычно наблюдают у бактерий, непосредственно выделенных от человека и животных. При длительных пересевах штаммов на питательных средах способность бактерий к образованию капсулы может утрачиваться. Для восстановления капсулообразования бактерии пассируют на средах, содержащих высокие концентрации углеводов и азота (среда Worfel-Fergusson) или пассируют через организм чувствительных лабораторных животных. На плотных питательных средах клебсиеллы образуют пышные, частично сливающиеся слизистые колонии. На жидких средах могут давать гомогенное помутнение, пленку или пристеночное кольцо. При использовании атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии можно видеть расположение бактериальных клеток клебсиелл в биопленке. Одновременно со слизистыми колониями на плотной питательной среде могут встречаться круглые прозрачные голубоватые бесслизистые S-колонии, либо мелкие и суховатые R-колонии.

В связи с этой особенностью различают несколько форм колоний в зависимости от наличия слизи, капсулы и полноценной структуры липополисахарида. Как и многие представители семейства Enterobacteriaceae, клебсиеллы имеют фимбрии (пили) — нитевидные выросты, исходящие из цитоплазмы и располагающиеся на поверхности клеток. Одна бактериальная клетка может иметь сотни фимбрий. Различают реснички (пили) общего типа (common pili, англ.) и половые (sex pili, англ.).

Синтез половых ресничек контролируется генами F-фактора, определяющего способность к передаче генетического материала в процессе конъюгации бактерий. Синтез ресничек общего типа детерминирован генами бактериальной хромосомы. По своей биологической сути пили являются адгезинами, участвующими в склеивании бактерий в агломераты, в прилипании к различным поверхностям и формировании биопленки. Известны два типа адгезии, выявленной в реакции гемагглютинации: маннозочувствительная (MS), подавляемая в присутствии D-маннозы, и маннозорезистентная (MR), не подавляемая D-маннозой. Фимбрии различают по морфологии, химическому составу, антигенной структуре и гемагглютинационному спектру. Реакция гемагглютинации служит диагностическим приемом для обнаружения штаммов, обладающих указанной адгезивной активностью.

в) Биохимические свойства. По своим биохимическим свойствам клебсиеллы являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофами и имеют метаболизм дыхательный или ферментативный. Температурный оптимум — 37°С, температурные границы для роста 10-43°С, оптимум pH — 7,2. Ферментируют углеводы с образованием кислоты и газа (существуют также не образующие газа штаммы). Оксидазоотрицательны и каталазоположительны. Большинство видов образует лизиндекарбоксилазу и не синтезируют орнитиндекарбоксилазу и аргининдигидролазу. По образованию индола, в пробе с метиловым красным, реакции Фогеса-Проскауэра, а также по способности расти на среде Симмонса с цитратом, виды варьируют. Способны расти в присутствии KCN, сероводорода не образуют. Уреазоположительны, восстанавливают нитрат. Биохимические свойства клебсиелл и раултелл представлены в таблице ниже.

Клебсиеллы способны обуславливать положительную хромогенную реакцию с 5-аминосалициловой кислотой (5-АСК). На первом этапе реакции уникальный фермент клебсиелл 5-аминосалицилатдекарбоксилаза отщепляет CO₂ от 5-АСК, образуя промежуточный бесцветный продукт парааминофенол, который на втором этапе реакции в аэробных условиях окисляется кислородом воздуха в полимер темно-коричневого цвета.

Хромогенную реакцию с 5-АСК дают все подвиды К. pneumoniae (pneumoniae, ozaenae, rhinoscleromatis), К. oxytoca, а также Enterobacter aerogenes. Клебсиеллы хорошо растут на средах Эндо, Плоскирева, Левина и МакКонки, образуя, как правило, колонии с металлическим блеском, характерным для бактерий, ферментирующих лактозу, или бледно-желтые или бежевые колонии, типичные для бактерий, не ферментирующих лактозу. Первичная внутриродовая дифференциация клебсиелл основана на 5 ключевых признаках: рост при температуре 10°С, способности ферментировать мелицитозу, орнитин, гистамин, образовывать индол.

Десять дифференцирующих признаков, позволяющих выявить подвиды К. pneumoniae, представлены в таблице ниже.

г) Факторы патогенности. Патогенность клебсиелл связывают также с наличием выраженной капсулы, синтезом фимбриальнызх белков адгезии (фимбрии или пили I и III типа). Вирулентные штаммы клебсиелл способны размножаться внутри фаголизосом макрофагов, могут продуцировать термолабильный и термостабильный энтеротоксины, тиолзависимый гемолизин, различного типа цитотоксины, сериновые протеазы с широким спектром протеолитической активности. Как все энтеробактерии, клебсиеллы и раултеллы обладают эндотоксином.

д) Лабораторная диагностика. Клебсиеллы известны как возбудители заболеваний дыхательного тракта: пневмонии, риносклеромы, озены. Описаны также случаи заболеваний урогенитального тракта, поражения суставов, различных гнойно-септических заболеваний, вызванных клебсиеллами. Кроме того, показано, что в стационарах второго этапа выхаживания новорожденных в этнологии гнойно-септических осложнений все большее значение начинает приобретать оппортунистическая флора (в том числе К. pneumoniae), которая нередко становится и причиной внутрибольничных инфекций.

Выделение предполагаемого возбудителя оппортунистической инфекции при подозрении на клебсиеллы осуществляется следующим образом. Материалом для исследования может быть ликвор, мокрота, гной, моча, кровь, желчь, фекалии. Исследуемый материал, за исключением жидкостей организма, которые в норме стерильны, засевают количественным методом. Мокроту предварительно гомогенизируют в банке со стерильными стеклянными бусами или любым другим известным способом с соблюдением асептики. Затем готовят ряд десятикратных разведений в питательном бульоне. Фекалии также предварительно гомогенизируют в фосфатном буфере pH 6,8-7,2, готовят десятикратные разведения в этом же растворе.

Так же поступают с любым другим материалом, который может содержать бактериальные клетки возбудителя.

Первый день. Посев исследуемого материала на дифференциально-диагностические среды — среду Эндо, лактозо-бромтимоловый агар с пенициллином и др. (при посеве количественным методом засевают 2-3 нечетных разведения 10³, 10⁵, 10⁷). Посевы помещают в термостат при 37°С на 18-24 ч.

Второй день. Просматривают чашки, засеянные накануне. Подсчитывают число выросших колоний (отдельно каждого вида). Клебсиеллы на указанных выше средах, как правило, образуют большие (диаметром до 3 мм), выпуклые, влажные, слизистые колонии, могут быть и небольшие суховатые колонии. Отбирают 2-3 подозрительные колонии для дальнейшего исследования. Отобранные колонии засевают на «пестрый ряд» для идентификации, для чего каждую колонию эмульгируют в небольшом количестве 0,9% раствора натрия хлорида и пастеровской пипеткой засевают на следующие среды: полужидкий (0,3-0,2%) агар, под пробку этой пробирки помещают полоску индикаторной бумаги на индол, агар Клиглера (не забыть проколоть столбик среды в пробирке!), среду с мочевиной по Преусу, нитратный агар Симмонса, фенилаланиновый агар, среды с аминокислотами — лизином и орнитином, среды Гисса с адонитом, инозитом, сорбитом, рамнозой и среду Кларка. Посевы помещают термостат при 37°С на 18-24 ч.

Третий день. Учитывают результаты определения ферментативных свойств. Неподвижные, индол-отрицательные или положительные, гидролизующие мочевину или не обладающие такой способностью, утилизирующие цитрат в качестве единственного источника углерода, лактозоположительные и лактозоотрицательные, обладающие декарбоксилазой только лизина или лизина и орнитина, ферментирующие адонит, инозит, сорбит, рамнозу, образующие и не образующие ацетилметилкарбинол (реакция Фогеса-Проскауэра), дающие отрицательную или положительную реакцию с метиловым красным культуры относят к клебсиеллам. Видовую принадлежность устанавливают по данным характеристики ферментативных свойств. При выделении клебсиелл из клинического материала, кроме стерильных в норме жидкостей организма, в концентрации 10⁵ КОЕ/мл и более, они могут быть заподозрены в качестве этиологического фактора заболевания.

е) Лекарственная устойчивость. Клинические штаммы клебсиелл обладают высокой устойчивостью ко многим антибиотикам, обычно применяемым в медицинской практике. Чувствительны к амикацину, аминогликозидам, менее чувствительны к цефалоспоринам. Приобретенная резистентность формируется в процессе лечения и зависит от тактики выбора и назначения препаратов. Полиантибиотикоустойчивые штаммы нередко являются причиной оппортунистических инфекций у иммунокомпрометированных больных. Чувствительность к антибиотикам определяют общепринятыми методами, чаще используют дискодиффузионный метод с отечественными или импортными дисками на среде АГВ или агаре Мюллера-Хинтона.

- Читать далее "Род условно-патогенных энтеробактер (Enterobacter): морфология, культуральные, биохимические свойства"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 4.4.2020