а) Таксономия. В отдельных статьях на сайте уже рассмотрена таксономия сальмонелл. На основании данных ДНК-ДНК гибридизации штаммы сальмонелл были подразделены на пять групп.

Штаммы, вызывающие заболевания у людей, отнесены к I группе, выделенные от животных и из окружающей среды — к группам II, IIIа, IIIb, IV, при этом все 5 групп близко родственны и могут рассматриваться как принадлежащие к одному виду. По правилам Бактериологического Кода, название этого вида Salmonella choleraesuis. Но такое видовое название может вызывать путаницу, поскольку имеет двойное значение — видовое и серотиповое. Во избежание путаницы было предложено оставить родовое название Salmonella, и все сальмонеллы, в том числе возбудители брюшного тифа, паратифов и пищевых токсикоинфекций, объединить в один вид с новым названием Salmonella enterica с 6-ю подвидами: S. enterica suhsp.enterica; S. enterica subsp. arizonae; S. enterica subsp. houtenae; S. enterica subsp. indica; S. enterica subsp.salame; S. enterica subsp. bongori. Название серотипа (сероваpa) предложено писать с заглавной буквы, например, Salmonella enterica subsp. Typhi, S. enterica subsp.

Paratyphi A, S. enterica subsp. Typhimurium, S. enterica subsp. Enteritidis и т.д. Последнее предложение, хотя и громоздкое, поддерживается большинством микробиологов мира. В настоящем издании мы будем обозначать серотипы сальмонелл так, как это посей день привычно для нас, т. е. согласно Bergey’s Manual 1994 года издания.

Множество подвидов сальмонелл содержит различные серовары, число которых на сегодняшний день превышает 2500. В практике медицинской микробиологии чаще используют серологическое дифференцирование сальмонелл по схеме Кауфмана и Уайта.

б) Морфология. Сальмонеллы — мелкие палочки с закругленными концами длиной от 1 до 3 мкм и толщиной около 0,5 мкм. Они, как правило, подвижны благодаря перитрихиально расположенным жгутикам. Представители сероваров S. gallinarum и S. pullorum всегда неподвижны. Спор и цист не образуют, истинных капсул не имеют, могут иметь микрокапсулу, величина и структура которой изменяются в зависимости от условий выращивания.

в) Физиология. Сальмонеллы хорошо растут на питательных средах для энтеробактерий. Для их выделения из клинического материала разработаны селективные среды обогащения, принцип действия которых базируется на устойчивости сальмонелл к таким веществам, как желчь, соли висмута, магния и селенита.

г) Культуральные свойства. В жидких питательных средах сальмонеллы дают диффузный рост. На плотной питательной среде (мясопептонном агаре) сальмонеллы образуют мелкие, диаметром 2-4 мм прозрачные, нежные голубоватые колонии. Бактерии сероваров S. abortus equi, S. abortus ovis и S. typhisuis образуют более мелкие колонии, диаметром около 1 мм. При посеве на среду Эндо они приобретают розоватый оттенок, прозрачны или полупрозрачны; на среде Плоскирева имеют цвет среды (коричневые), становятся желтыми или непрозрачно-бесцветными, выглядят более плотными и мутноватыми; На ЭМС-агаре (эозин с метиленовым синим, среда Левина) они прозрачны, с фиолетовым оттенком.

На висмут-сульфит агаре — черные с металлическим блеском, при этом питательная среда под колониями окрашена в черный цвет. Подавляющее большинство госпитальных штаммов сальмонелл обладает атипичными свойствами: например, на висмут-сульфит агаре формируют вместо черных серо-зеленые или бурые колонии.

д) Биохимические свойства. Типичная культура, принадлежащая к роду Salmonella, характеризуется следующими биохимическими признаками: индол не образует; мочевину не разлагает; расщепляет цитрат натрия на среде Симмонса; реакция Фогеса-Проскауэра отрицательная; реакция с метиловым красным на среде Кларка положительная; ферментирует лизин, орнитин, маннит, мальтозу, сорбит, рамнозу; отсутствие ферментации сахарозы, раффинозы, салицина. Атипичные свойства чаще всего встречаются у штаммов, вызывающих госпитальные инфекции и выделенных из ран и абсцессов. Одним из наиболее важных признаков, используемых для идентификации представителей рода, является неспособность сальмонелл ферментировать лактозу (кроме S. enterica subsp. diarizonae). Большинство сальмонелл ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, однако описаны варианты, когда при ферментации глюкозы S. typhimurium выделение газа не происходит.

Сальмонеллы, как правило, обладают тиосульфатредуктазой, расщепляющей неорганические серосодержащие вещества с образованием сероводорода. Активность фермента возрастает с увеличением частичного анаэробиоза, степень которого зависит от глубины погружения колоний в агар. Образование сероводорода регистрируется на висмут-сульфитном агаре, на котором колонии сальмонелл за счет выделенного ими сероводорода окрашиваются в черный цвет. Отсутствие продукции индола — характерное свойство сальмонелл.

Следует учитывать тот факт, что имеется не менее 30 сероваров сальмонелл, образующих индол. Известно, что в пределах одного серовара встречается большее или меньшее число стабильных биохимических вариантов бактерий. Выделение биоваров основано на ферментативной активности штамма по отношению к углеводам. В частности, у S. typhimurium имеется 25 стабильных биоваров, причем биовары S. enteritidis, S. dublin даже получили отдельные названия.

е) Устойчивость к факторам внешней среды. Сальмонеллы во внешней среде могут не только сохранять свою жизнеспособность, но и активно размножаться. В воде открытых водоемов и питьевой воде они сохраняют жизнеспособность от 11 до 120 суток, в морской воде — от 15 до 27 сут., в почве от 1 до 9 мес., в комнатной пыли от 80 дней до 18 мес., в колбасных изделиях от 60 до 130 сут., в куриных яйцах до 13 мес. Наиболее устойчивыми являются 5. typhimurium, которые могут оставаться жизнеспособными на тканях и бумаге от 7 до 12 мес. Сальмонеллы могут расти при температуре от 7°С до 45°С, оптимальная температура составляет 35-37°С. Существенное влияние на рост сальмонелл оказывает pH среды. Они могут выдерживать pH не ниже 4,1 и не выше 9,0; оптимальное значение pH 6,5-7,5.

Рост сальмонелл могут подавлять или ограничивать высокие концентрации соли и сахара. Кипячение убивает сальмонелл мгновенно. При замораживании, наоборот, они могут оставаться жизнеспособными более длительное время. Наиболее эффективным дезинфицирующим средством в отношении сальмонелл является осветленный раствор хлорной извести; хлорирование сточных вод в 6 раз снижает их обсемененность сальмонеллами.

ж) Антигенная структура. У сальмонелл сложная антигенная структура, которая при этом не является стабильной. Она имеет мозаичное строение и определяет разнообразие антигенных вариаций. Изменения могут коснуться практически всех известных антигенных компонентов, что, в первую очередь, приводит к изменению морфологических свойств микроорганизма. На практике это выливается в проблему нетипируемых штаммов. Термостабильный О-антиген — липополисахарид (ЛПС) расположен на поверхности клеточной стенки бактерий и состоит из фосфолипидо-полисахаридных комплексов. Специфичность О-антигена обусловлена структурными особенностями концевых участков полисахаридных цепочек. В соответствии с содержанием определенных компонентов О-антигенов сальмонеллы разделяют на серологические группы.

Учитывая сложный состав О-антигенных комплексов, Кауфман и Уайт предложили схему, по которой представители рода Salmonella разделены на 65 серогрупп в соответствии с определенным набором О-антигенных фракций. Жгутиковый Н-антиген сальмонелл делят на две группы: I — специфическую (наиболее часто встречаемую) — и II — неспецифическую (редко встречаемые антигенные детерминанты). Состав антигенов, определяющий антигенную формулу сальмонелл, не является стабильным. Различают несколько видов антигенных вариаций: S-R-вариации — переход от гладкой формы (S-форма) к шероховатой (R-форма), влияющий на качественное и количественное изменение О-антигена. Трудность идентификации колоний по виду (гладкая, шероховатая) состоит в том, что в ряде случаев колонии по виду являются шероховатыми, а по серологическим свойствам содержат антигены гладких колоний, и наоборот. Возникновение S-R-вариации О-антигена можно доказать по поведению штаммов в изотоническом растворе хлорида натрия — культуры из R-форм колоний выпадают в виде нестойкого агглютината, а из S-форм — остаются во взвешенном состоянии.

При кипячении культуры в изотоническом растворе NaCl R-форма образует осадок на дне пробирки, в то время как культуры в S-форме находятся во взвешенном состоянии. Во избежание S-R-вариации культур среда для хранения штаммов сальмонелл не должна содержать углеводов, а пересевы необходимо производить как можно реже. Н-О-вариации состоят в переходе из жгутиковой (НО-формы) в безжгутиковую О-форму. Неподвижные серовары, к которым относятся S. gallinarum и S.pullorum, существуют только в О-форме. Vi-антиген, синтезируемый, как правило, S. typhi, является полимером N-ацетиламино-гексуроновой кислоты. Он термолабилен (полностью разрушается при кипячении в течение 10 мин) и принадлежит к группе поверхностных К-антигенов. Помимо брюшнотифозных бактерий, Vi-антиген может быть обнаружен у единичных штаммов Escherichia coli и Citrobacter freundii. Помимо указанных выше трех основных антигенных комплексов у сальмонелл обнаружены также М- и Т-антигены. М-антиген (мукоидный антиген) обладает слабыми иммуногенными свойствами — это кислый полисахарид, основной структурный компонент которого — коланиковая кислота. Т-антиген является видоизмененным О-антигеном. Входящие в его состав липополисахариды содержат только неразветвленные цепочки полисахаридов. Для определения сероваров сальмонелл по классификации Кауфмана и Уайта выявляют структуру О- и Н-антигенных комплексов.

з) Патогенез. Представители рода Salmonella в основном являются возбудителями кишечных инфекций, но могут проявлять себя как условно-патогенные микроорганизмы, особенно при развитии внутрибольничных инфекций, при которых наиболее часто выделяют серовары S. typhimurium, S. enteritidis, S. infantis и S. haifa. Попадание сальмонелл в ослабленный организм госпитальных больных может привести к развитию септицемии, пневмонии, менингита, артрита и др. Считается, что 0,1 % людей после перенесенного заболевания становятся носителями сальмонелл. Сальмонеллезное бактерионосительство по международной классификации определено как самостоятельная нозологическая форма заболевания. При типичной пищевой токсикоинфекции сальмонеллезный инфекционный процесс характеризуется локальным воспалительным поражением лимфоидной системы тонкой и проксимальной части толстой кишки (сальмонеллезный энтероколит). Полиморфно-ядерные лейкоциты ограничивают возможность развития генерализованной инфекции из лимфатических узлов кишечника, в связи с чем воспалительный процесс часто протекает без бактериемии.

Инфекционная доза для развития острого энтероколита, вызванного, например, Salmonella typhimurium, составляет не менее 100 тыс. жизнеспособных клеток возбудителя. По-видимому, клетки внутрибольничных S. typhimurium могут избирать в качестве входных ворот миндалины (и легкие) и появляться там до обнаружения в кишечнике и до диссеминации процесса. После адгезии S. typhimurium на поверхности клеток-мишеней (в основном М-клеток слизистой оболочки тонкой кишки) активируется каскадная сигнальная цепь последовательных взаимообусловленных процессов. На первом этапе поражаемая клетка выбрасывает в месте тесного контакта с бактерией тонкие отростки (инвасомы), обеспечивающие интернализацию (эндоцитоз) сальмонелл в составе мембраносвязанной вакуоли. Одновременно наблюдается дегенерация микроворсинок М-клетки и колебания ее поверхностной мембраны, возникающие вследствие образования на поверхности клетки вокруг входящих бактерий подвижных тонких отростков, содержащих актин. Далее происходит реаранжировка (перестроение) актиновых филаментов и целого ряда других цитоскелетных протеинов с активацией инозит-фосфолипидного пути и освобождением Са²⁺ в цитозоль.

и) Факторы патогенности. Патогенность сальмонелл определяется их способностью к инвазии в кровеносную и лимфатическую систему человека и животных. По характеру проявления патогенных свойств сальмонеллы делят на две группы: монопатогены и полипатогены. Внутрибольничные штаммы S. typhimurium слабо патогенны для белых мышей. Успешной колонизации бактерий способствует наличие факторов тропизма — адгезинов. Сальмонеллы продуцируют комплекс экзотоксинов, в состав которых входят: термолабильный и термостабильный энтеротоксины, усиливающие секрецию жидкости в просвет кишечника; цитотоксин, нарушающий белок-синтезирующие функции в клетках слизистой оболочки кишечника. Как и все энтеробактерии, сальмонеллы содержат липополисахарид (ЛПС) — эндотоксин, обладающий иммуномодулирующем действием. Развитие патологического процесса, степень его генерализации зависят от вирулентности штамма сальмонелл и от состояния иммунной системы макроорганизма.

к) Генетический контроль вирулентности. Примерно от 60 до 120 генов требуется для проявления вирулентности S. typhimurium при внутрибрюшинном заражении мышей, и от 200 до 500 генов — при их пероральном инфицировании. У S. typhimurium описано наличие пяти геномных островов патогенности, обозначенных как SPI-1, SPI-2 и т.д. (Salmonella pathogenicity island, англ.,). У S. bongori, авирулентных для человека, в геноме отсутствует «остров» патогенности SPI-2. SPI-1 локализован на хромосоме, контролирует инвазию сальмонелл в эпителиальные клетки и индуцирует апоптоз. SPI-1 содержит более 30 генов, основными из которых является inv (invasion — инвазия, англ.,) - гены, необходимые для инвазии эпителиальных клеток и ряд генов, расположенных в одном опероне (entry орегоп, оперой входа, англ.), ответственные за доставку эффекторных белков в цитоплазму и регуляцию их сиптеза. Гены «островов» патогенности SPI-2, SPI-3, SPI-4 и SPI-5 также локализованы на хромосоме сальмонелл и связаны со способностью сальмонелл к выживанию и размножению в фагоцитах ретикуло-эндотелиальной системы.

Каждый геномный «остров» патогенности включает гены системы секреции III или другого типа, осуществляющих доставку активных биомолекул в цитозоль поражаемых клеток. Для экспрессии вирулентности сальмонелл важным является кооперация хромосомных генов и генов собственных (специфических) плазмид, различающихся по молекулярной массе у определенных серотипов. Важное значение имеют плазмидые гены — spv (Salmonella plasmid virulence, англ.) и ген rck (resistance complement killing, англ.). Хромосомный pss-ген (ОМР protection killing, англ.), кодирующий белок 59 kDa, важный для размножения сальмонелл в полиморфно-ядерных лейкоцитах и макрофагах — защиты возбудителя от действия кислородных радикалов при слиянии фагосомы с лизосомой. Размеры собственных плазмид вирулентности у разных серотипов сальмонелл различны: у S. typhimurium — 60 МDa (85 kb), у S. dublin — 50 MDa (80 kb), S. enteritidis — 36 MDa (59 kb), S. pullorum 39 MDa, S. choleraesuis — 30 MDa (50 kb), S. heidelbrg — 62 MDa. Плазмиды размером 54-100 kb обнаружены также у S. newport. Бактериальные клетки S. agona, S. inf antis, S. saintpaul и S. seftenberg собственных плазмид не имеют. Выявлена гомология собственных плазмид вирулентности, обнаруженных у 5. dublin, S. enteritidis, S. pullorum, S. choleraesuis и S. heidelberg с плазмидой вирулентности S. typhimurium.

Элиминация плазмид сальмонелл сопровождается снижением устойчивости клеток к бактерицидному действию сыворотки крови. Полагают, что собственные плазмиды вирулентности сальмонелл играют роль в развитии системного инфекционного процесса. Определенное значение имеют регуляторные гены: pag (phoP activated gene, англ.), prg (phoP repressor gene, англ.) и org (oxygen-regulated invasion, кислород-регулируемые гены инвазии, англ.), активирующие или подавляющие экспрессию хромосомных генов инвазии. Негативно контролируется экспрессия плазмидных белков вирулентности SpvA и SpvB. При вхождении сальмонелл в энтероциты и их захвате макрофагами SpvR-протеин запускает активацию всех spv-генов. Для регуляции транскрипции этих генов служит система генов σ-фактор-S-katF регулирующая функцию ряда генов при размножении сальмонелл в организме хозяина.

л) Лабораторная диагностика строится в соответствии с патогенезом заболевания. Выбор материала для исследования при подозрении на сальмонеллезную инфекцию зависит от срока с момента заболевания.

Первый день. Исследуемые образцы крови засевают в желчный бульон или среду Раппопорт и Вайнтрауба в соотношении 1:10. При засеве фекалий используют дифференциально-диагностические среды Плоскирева, висмут-сульфитный агар и среды обогащения для сальмонелл: (1) селенитовую среду, содержащую пептон, одно- и двузамещенный фосфорнокислый натрий, лактозу и селенит натрия в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры, (2) магниевую среду, содержащую пептон с дрожжевым диализатом, калий фосфорнокислый двузамещенный, хлористые соли калия, магния, натрия и бриллиантовый зеленый для ингибирования сопутствующей микрофлоры, (3) среду Мюллера, состоящую из бульона Хоттингера, солей кальция, тиосульфата натрия, раствора Люголя, избирательно подавляющего рост сопутствующей микрофлоры кишечника и не влияющего на рост сальмонелл, (4) среду Мюллера-Кауфмана, содержащую бычью желчь и бриллиантовый зеленый. Посевы помещают в термостат при 37°С. При подозрении на пищевую токсикоинфекцию исследуют рвотные массы и промывные воды желудка.

Второй день. Из посевов крови делают высев на дифференциальные среды Плоскирева, Эндо, Левина (рецепты всех трех сред), висмут-сульфит агар. При обнаружении прозрачных или полупрозрачных, бесцветных или светло-розоватых, не разлагающих лактозу (на средах Плоскирева или Эндо), и серовато-зеленых с черным центром (на висмут-сульфит агаре) колоний, производят посев на среду Клиглера, среду Олькеницкого. (трехсахарный агар с мочевиной), в пробирку с полужидким 0,3-0,4%-ным агаром, под пробку которой помещают индикаторную бумажку на индол. На агар Клиглера посев сначала делают на скошенную поверхность, а затем уколом в столбик. В этот же день производят высевы со сред обогащения на среду Плоскирева или висмут-сульфит агар.

Третий день. Оценивают ферментативные свойства, при необходимости проводят посевы на среды с лизином, цитратный агар Симмонса, среду Кларка, среды Гисса с углеводами, необходимыми для определения биоваров сальмонелл.

Червертый день. Проводят учет ферментативных свойств, определяют антигенную структуру в реакции агглютинации на стекле с О-агглютинирующими сыворотками. После выявления О-антигена определяют Н-антигены: устанавливают наличие I и II фаз с соответствующими монорецепторными сыворотками. Для проведения реакции агглютинации с О-сыворотками используют культуру с верхней части скошенного агара, для Н-агглютинации — с нижней. На основании полученных данных выдают ответ.

м) Генотипирование изолятов. Методы генотипирования диктуются необходимостью оценки эпидемиологической ситуации в ЛПУ и выявления очага оппортунистической инфекции. Для этой цели используются два подхода генотипирования изолятов: первый, основанный на анализе длин (полиморфизма) рестрикционных фрагментов ДНК (RFLP), включая пульс-электрофорез в переменном токе (PFGE), и второй способ, получивший название мультилокусного секвенирования-типирования (MLST), основанный на анализе геномной последовательности ДНК. Для первого подхода важную роль играет информация, полученная при изучении выявленных сайтов рестрикции для известных рестриктаз. Метод MLST позволяет дифференцировать клоны патогенных бактерий на основании единичных нуклеотидных замен в том или ином гене, однако метод требует наличия данных о специфичных последовательностях, характерных для генома типируемого микроорганизма. Известен также метод RAPD-типирования (Randomly Amplified Polymorphic DNA, англ.) с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Следует отметить, что стоимость и затраты времени ограничивают использование указанного метода на практике. В связи с этим преимущество на практике получили ПЦР, RFLP и PFGE.

1. ПЦР. Для быстрого обнаружения энтеробактерий в клиническом материале предложена ПЦР с праймерами, выявляющими последовательности генов 16S рРНК и/или генов inv и vir. Проведение ПЦР детально изложено в статьях на сайте - просим пользоваться формой поиска выше.

2. RFLP успешно применяется для типирования клинических изолятов сальмонелл. Для рестрикции обычно используют крупнощепящие эндонуклеазы, поскольку рестрикция бактериальной геномной ДНК эндонуклеазами, распознающими короткие последовательности из 4 или 6 нуклеотидов, приводит к образованию нескольких сотен фрагментов, и после электрофореза получается достаточно сложный для интерпретации и сравнения профиль ДНК-фрагментов.

3. PFGE-типирование позволяет эффективно разделять фрагменты бактериальной ДНК, обработанной крупнощепящими рестриктазами, что облегчает раздельное перемещение крупных фрагментов ДНК в агарозном геле путем постоянного изменения направления электрического поля в ходе электрофореза. PFGE включает лизис бактериальных клеток для выделения неповрежденной хромосомной ДНК, удаление примесей, нарезание хромосомной ДНК соответствующими рестриктазами. Пульс-электрофорез фрагментов ДНК и их визуализация применяется как универсальный метод субтипирования многих бактерий. Полученные в PFGE профили рестрикцированной ДНК стабильны и хорошо воспроизводимы. PFGE является методом выбора для эпидемиологического типирования изолятов в эпидемиологических целях.

4. RAPD-PCR шинирование с использованием произвольных праймеров является более быстрым и простым методом и широко используется для изучения вспышек инфекционных заболеваний, ограниченных во времени. Метод удобен для использования в ежедневной практике как дополнение к биохимической идентификации изолятов, если результаты биотипирования оказываются недостаточно информативными.

С целью разработки стандартизованных протоколов молекулярного субтипирования для всех бактериальных диарейных инфекций Центром контроля болезней США (CDC — Center Diseases Control) был основан проект PulseNet, первоначально объединивший 10 лабораторий. PulseNet — система раннего предупреждения вспышек инфекций с пищевым путем передачи возбудителя. В настоящее время PulseNet — национальная сеть молекулярного субтипирования возбудителей инфекций, передающихся с нищей. Она включена в сеть лабораторий системы здравоохранения и CDC. Эти лаборатории проводят типирование ДНК внутрибольничных штаммов Salmonella, Shigella, Escherichia coli O157:H7 и др. Сеть позволяет проводить быстрое сравнение профилей PFGE-типирования через электронную базу данных, предоставляет информацию для раннего выявления и своевременного расследования вспышек инфекции, что должно способствовать снижению заболеваемости.

5. Лекарственная устойчивость. Внутрибольничные штаммы сальмонелл обладают высокой устойчивостью ко многим антимикробным препаратам, обычно применяемым в медицинской практике. Они чувствительны к амикацину, аминогликозидам, сохраняют чувствительность к амоксициллину, цефотаксиму и цефуроксиму. Следует отметить устойчивость изолятов к ампициллину, эритромицину, кларитромицину, линкозамиду, хлорамфениколу и тетрациклину. Как правило, внутрибольничные изоляты устойчивы к трем и более антибактериальным препаратам, что связано с приобретением плазмид множественной лекарственной резистентности. Приобретенная устойчивость формируется в процессе лечения и зависит от тактики выбора и назначения препаратов. Важно определить чувствительность изолята к антимикробным препаратам общепринятыми методами, используя в основном дискодиффузионный метод с отечественными или импортными дисками на среде АГВ или агаре Мюллера-Хинтона.

н) Лечение и профилактика. Используют антимикробные этиотропные препараты: ципрофлоксацин, доксициклин, ко-тримоксазол и др. Общие мероприятия по профилактике внутрибольничных инфекций заключаются в своевременном выявлении источников инфекции, их обеззараживании, а также санации сальмонеллезных бактерионосителей. Имеется опыт отечественных эпидемиологов об успешном применении для профилактики внутрибольничной инфекции, вызываемой в крупном стационаре S. typhimurium, специфического лечебного бактериофага. Большое значение имеет охрана от загрязнения сальмонеллами питьевой воды и продуктов питания.

- Читать далее "Роды условно-патогенных клебсиелл (Klebsiella) и Raoultella: морфология, культуральные, биохимические свойства"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 4.4.2020