Способы стерилизации питательных сред в микробиологии

Известно много способов стерилизации, которые разделяют на две основные группы: термическую и холодную стерилизацию.

а) Термическая стерилизация. Наиболее широко используются:
— стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование);
— стерилизация текучим паром;
— тиндализация.

Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование) и ее контроль. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава. Это один из наиболее эффективных методов, основанных на прогревании субстрата насыщенным паром в автоклавах — аппаратах, работающих под давлением выше атмосферного, так как с повышением давления пара повышается и его температура.

Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает надежность стерилизации. Среды, предназначенные для стерилизации в автоклаве, разливают в посуду не более чем на 1/2 емкости и закрывают ватно-марлевыми и резиновыми пробками, которые завальцовывают.

Наиболее часто используемый режим стерилизации +121 °С в течение 15 мин (тиогликолевая среда, МПА, МПБ, бульон Хоттингера, агар Хоттингера и др.). Питательные среды, в составе которых имеются термолабильные вещества, стерилизуют при более низких температурах и давлении. Так, например, режим 112°С в течение 20 мин используется для сред, содержащих углеводы (среды Гисса), витамины, молоко, желатин, режим 110°С в течение 30 мин — для среды Тароцци (содержит углеводы и мясной фарш), режим 100 °С в течение 15 мин — для среды с мочевиной.

При выборе режима стерилизации необходимо учитывать не только состав среды, но и ее pH. При значительных отклонениях pH от нейтрального уровня полимерные компоненты среды могут подвергаться гидролизу. Так, например, в среде с pH ниже 6,0, содержащей желатин, происходит нентонизация последнего, и среда не затвердевает даже при охлаждении, а при pH ниже 5,0 гидролизуется агар, утрачивая свойство образовывать плотный гель.

При стерилизации среды, имеющей щелочную реакцию, карамелизуются углеводы, выпадают в осадок соли некоторых металлов.

Чтобы избежать подобных явлений, желательно стерилизовать среды при нейтральном значении pH, а после автоклавирования подкислить или подщелочить их стерильными растворами кислот или щелочей соответственно.

Для коммерческих питательных сред режим стерилизации указывается в инструкциях по их применению.

Питательные среды

Стерилизация текучим паром применяется для сред, содержащих вещества, разлагающиеся при температуре выше 100 °С (аммиачные соли, молоко, желатин, картофель, некоторые углеводы). Стерилизацию проводят в автоклаве при открытом спускном кране и незавинченной крышке или в аппарате Коха по 15-30 мин в течение 3 дней подряд. При первом сеансе погибают вегетативные формы микроорганизмов, но споры сохраняются и прорастают в вегетативные особи в процессе хранения среды при комнатной температуре в промежутках между сеансами. Последующие сеансы достаточно надежно обеспечивают стерильность среды.

Тиндализация применяется для стерилизации питательных сред, имеющих в своем составе легко разрушающиеся при высокой температуре компоненты (сыворотки, витамины).

Прогревание стерилизуемой среды производят на водяной бане, снабженной терморегулятором, по 1 ч при температуре 60-65 °С в течение 5 дней или при 70-80 °С в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями среды выдерживают при температуре 25-27 °С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Эффективность тиндализации, как и стерилизации текучим паром, зависит от того, прорастут ли споры. Поэтому она не достигает цели, если споры находятся в среде, непригодной для роста или содержащей ингибиторы роста, либо среда в промежутках между нагревами инкубируется при температуре, неблагоприятной для прорастания спор.

После стерилизации среды охлаждают до 45-50 °С и разливают, соблюдая правила асептики, в стерильные чашки, обычно по 15-20 мл, что соответствует высоте слоя 0,25-0,30 см. Чем толще слой, тем менее контрастно выглядят колонии. При тонком же слое ухудшается рост микроорганизмов в связи с поступлением меньшего количества питательных веществ. Среда должна быть равномерно распределена по дну чашки, не содержать пузырьков воздуха. Необходимым условием получения изолированных колоний является отсутствие конденсата на поверхности питательной среды.

Для этого перед посевом среду необходимо подсушить, поместив открытые чашки со средой в термостат и выдержав при температуре 37 °С в течение 40-60 мин.

б) Холодная стерилизация. Основными способами холодной стерилизации являются различные типы фильтрования и облучения. Такой стерилизации подвергаются растворы веществ, которые при нагревании разрушаются или существенно изменяют свои свойства, например, многие витамины, антибиотики, ферменты,, сыворотки и др.

в) Стерилизация фильтрованием. Для стерилизации фильтрованием используют фильтры, изготовляемые из материалов с различными физико-химическими свойствами, разной пропускной и адсорбционной способностью (мембранные, асбестовые, стеклянные, фарфоровые). Этот способ применяют для аминокислот, в частности триптофана, глутамина и аспарагина, которые являются высоко лабильными, и но этой причине их нельзя нагревать, в связи с чем стерилизацию проводят путем ультрафильтрования.

г) Стерилизация облучением. В целях стерилизации используют УФ-облучение с длиной волны 254 нм, однако его применение ограничено из-за малой проникающей способности. От УФ-лучей микроорганизмы могут быть защищены органическими веществами, пылью, стеклом или другим покрытием, а гибель микробных клеток вызывает только непосредственное и продолжительное воздействие. В силу этого УФ-облучению с целью стерилизации подвергают биологические жидкости, разлитые тонким слоем, например кровь, плазму, вакцины.

Гамма-лучи, обладающие высокой проникающей способностью, могут быть использованы для стерилизации жидких и плотных питательных сред, различных биологических жидкостей и растворов. Однако в связи со специфическими требованиями по технике безопасности при работе с источниками этих излучений, а также с высокой стоимостью они используются в практике работы только крупных предприятий.

- Читать далее "Условия и сроки хранения питательных сред в микробиологии"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 20.05.2019

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.