Основные требования, предъявляемые к питательным средам:

1. Наличие всех необходимых источников питания в усваиваемой форме в соотношениях, соответствующих соотношениям их в клетках. Как недостаток, так и избыток питательных элементов оказывает негативное воздействие на рост микроорганизмов. В некоторых случаях среды должны содержать специальные ростовые факторы. По возможности среды должны быть унифицированы в отношении содержания основных компонентов (аминный азот — 0,8-1,2 г/л, общий азот — 2,5-3,0 г/л, хлориды (в пересчете на хлорид натрия) — 0,5-0,8%).

2. Создание необходимого уровня кислотности — pH среды, при котором у культивируемого микроорганизма наиболее активно протекают процессы жизнедеятельности. Естественно, pH среды зависит от вида культивируемого микроорганизма. Большинство микроорганизмов хорошо растет при слабощелочной реакции среды (pH 7,2-7,4). Некоторые микроорганизмы (палочка туберкулеза, грибы) требуют слабокислой реакции среды, другие (холерный вибрион) — щелочной реакции (pH 7,8-8,2).

3. Наличие определенного окислительно-восстановительного потенциала (Eh), который зависит от состава питательной среды, степени насыщения ее кислородом, а также от уровня pH (чем ниже pH, тем выше Eh и наоборот). Для снижения Eh питательной среды из нее вытесняют воздух путем кипячения или при помощи инертных газов (аргона, азота, гелия) и добавляют редуцирующие вещества.

4. Среды должны быть изотоничными для микробных клеток, т.е. осмотическое давление в них должно быть практически таким же, как внутриклеточное, что достигается добавлением в питательные среды солей.

5. Среды должны иметь достаточную влажность. Вода — важнейший компонент всех питательных сред; при отсутствии влаги замедляются или полностью прекращаются процессы жизнедеятельности микроорганизмов. При этом у кокковых грамположительных бактерий устойчивость к отсутствию влаги выше, чем у палочковидных грамотрицательных.

6. Отсутствие ингибиторов роста.

7. Среды должны быть стерильными.

Кроме того, важным требованием, предъявляемым к большинству питательных сред, является отсутствие свойств, которые могут затруднить или сделать невозможным визуальный контроль за процессами жизнедеятельности микроорганизмов, т. е. среды должны быть безупречными по цветности, прозрачности и консистенции.

Среды лабораторного приготовления должны изготавливаться в строгом соответствии с рецептурой (качественно-количественном составом), описанной в соответствующих документах, при обязательном контроле перед использованием по всем показателям, необходимым для данного типа среды.

Для получения качественных, стабильных но составу питательных сред необходимо выполнять в процессе их изготовления определенные условия.

Важнейшее из этих условий — соблюдение последовательности внесения компонентов, указанной в инструкции по их изготовлению. Отклонение от этого правила может привести к помутнению среды, образованию осадка. Последовательное растворение компонентов в дистиллированной воде проводят при нагревании и постоянном перемешивании с визуальным контролем за полнотой их растворения.

Продолжительность нагрева среды должна быть минимальной, так как в результате длительного воздействия повышенных температур возможно разрушение и изменение свойств отдельных компонентов.

Особого внимания требует коррекция pH среды на всех стадиях ее изготовления. Коррекцию pH следует вести осторожно, чтобы не допустить существенного подкисления или перещелачивания среды и таким образом избежать необходимости повторной коррекции. Дополнительное внесение кислот и щелочей не только влияет на химические процессы, протекающие в среде, но и увеличивает концентрацию минеральных солей.

Кроме того, необходимо учитывать, что в процессе стерилизации сред автоклавированием этот показатель, в зависимости от состава среды, может изменяться в той или иной степени. В этом случае вводится соответствующая поправка к уровню pH, устанавливаемому в среде до стерилизации, с тем чтобы в готовой стерильной среде он соответствовал требуемому значению. После стерилизации pH контролируют вновь.

Некоторые компоненты следует стерилизовать отдельно в связи с их чувствительностью к нагреванию или к действию pH при повышенной температуре. Например, в средах с повышенным уровнем pH (8,0), содержащих глюкозу, после стерилизации pH снижается до 5,0-6,0, а глюкоза карамелизуется, и среда приобретает темную окраску. Для таких сред глюкозу стерилизуют отдельно при pH 5,0 и вносят в стерильную среду перед посевом.

Приготовление питательных сред из сухих коммерческих препаратов осуществляют в строгом соответствии с этикеткой и инструкцией по применению.

Причинами, по которым из сухих сред могут быть получены некачественные готовые среды, являются ошибки потребителя в процессе их приготовления, а именно — при взвешивании, регулировании pH, стерилизации и др.

Обязательными условиями являются: полное растворение препарата в соответствующем объеме холодной дистиллированной воды; постоянное перемешивание в течение нагревания (чтобы не допустить осаждения агара на дно, где он может карамелизоваться и обуглиться). Для достижения полного растворения компонентов среду следует кипятить 1-2 мин до образования крупно-пузырчатой пены, а после оседания последней — возобновить нагрев.

Среда обычно готова к применению после трехкратного образования и оседания пены. После того как сухая среда растворится, ее пропускают через ватно-марлевый фильтр (в стеклянную воронку помещают марлевую салфетку, а на нее слой ваты) или через бумажный фильтр.

Среду разливают в пробирки или колбы и подвергают стерилизации.

Важным условием качественного микробиологического исследования является правильный подбор питательных сред для посева клинического материала. Для материала, содержащего разнообразную микрофлору (испражнения, гнойное отделяемое), лучше использовать высокоселективные среды (висмут-сульфит-агар— для выделения сальмонелл, бактоагар Плоскирева — для выделения сальмонелл и шигелл, элективный солевой агар — для стафилококков). Для исследования крови и спинномозговой жидкости, в норме не содержащих микроорганизмов, необходимы слабоселективные среды (среды Эндо, Левина, Бунина).

На высокоселективные среды материала наносится больше, чем на слабоселективные.

- Читать далее "Способы стерилизации питательных сред в микробиологии"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 20.05.2019