Бактериоскопическая, бактериологическая диагностика возбудителя сифилиса (Treponema pallidum)

Для диагностики сифилиса используются методы, позволяющие обнаружить возбудитель (микроскопия, иммуногистохимические методы, ПЦР) или зафиксировать антительный ответ организма на внедрение бледной трепонемы (серологическая диагностика). В целом диагноз сифилиса основывается на совокупности клинических проявлений, данных серологического тестирования и обнаружении Т. pallidum в тканевой (серозной) жидкости или в гистологических срезах. На практике перечисленные клинико-диагностические исследования не всегда выполняются в полном объеме, что объясняется конкретными обстоятельствами. Каждый из указанных диагностических методов имеет свою ценность и, что очень важно, очевидную целесообразность.

Так, например, для диагностики скрытого сифилиса решающим являются данные серологических исследований. В то же время серологические тесты мо1ут быть отрицательными и при наличии клинических проявлений первичного и даже вторичного сифилиса. Поэтому, помимо серологических исследований, для диагностики ранних манифестных форм сифилиса наиболее ценным является обнаружение бледных трепонем методом микроскопии.

а) Микроскопическое исследование. Бледную грепонему следует искать во всех элементах (эрозии, язвы, мокнущие папулы), подозрительных на сифилис, и обязательно — при расположении этих элементов на половых органах. Материалом для исследования служит тканевая жидкость -- серозное отделяемое (серум) эрозивноязвенных элементов или жидкость (пунктат) лимфоузлов. Для получения серозной жидкости, свободной от примеси крови, необходимо прежде всего очистить поверхность эрозий, язв или папул от корочек и гноя. Перед взятием материала элементы обрабатывают ватным или марлевым тампоном, обильно смоченным стерильным физиологическим раствором. Тампон прикладывают к поверхности язвы или эрозии, стараясь их нс травмировать во избежание кровотечения. Если шанкр инфицирован и покрыт обильным гнойным экссудатом, то для очищения поверхности накладывают примочки с физиологическим раствором на срок 1-2 сут. После удаления наслоений корочек и гноя поверхность шанкра осушают сухим тампоном.

Затем к поверхности эрозивно-язвенных элементов прикладывают прокаленную и остуженную бактериологическую петлю или лопаточку и, слегка нажимая, раздражают ее, стремясь получить тканевую жидкость из глубины шанкра. Процедуру повторяют несколько раз до получения прозрачной тканевой жидкости. Если подобным образом ее получить не удалось, то необходимо зажать шанкр с боков двумя пальцами и осторожно надавливать с разных сторон до выхода на поверхность капель прозрачной жидкости. Каплю серозного экссудата наносят на предметное стекло, где смешивают с каплей физиологического раствора и накрывают предметным стеклом. Препарат, приготовленный таким образом, готов для микроскопии в темном поле.

При необходимости получить трепонему с поверхности, на которой отсутствует мацерация, материал добывают путем скарификации элементов (пятен, папул) скальпелем или лезвием безопасной бритвы, стараясь максимально избежать выхода крови. При взятии материала из полости рта необходимо избегать попадания слюны из-за возможного содержания в ней Т. dentalis. В случаях, когда шанкр располагается в недоступных местах или же невозможно дифференцировать вульгарные трепонемы от бледной, производится пункция регионарного лимфоузла. Для этого в ткань узла вводят 0,2 мл стерильного физиологического раствора и слегка массируют узел, после чего отсасывают содержимое и далее производят микроскопию в темном поле.

Бактериоскопическая, бактериологическая диагностика возбудителя сифилиса (Treponema pallidum)
Микроскопия бледной трепонемы в темном поле.

Микроскопия в темном поле проводится при помощи светового микроскопа, оборудованного специальной конденсорной линзой, создающей своеобразный световой эффект так называемого темного поля. Он основан на феномене Тиндаля, согласно которому узкая полоса света при прохождении через темное пространство высвечивает все, что оказывается на его пути, при этом становятся видимыми даже мельчайшие частицы, которые при обычном освещении увидеть невозможно. Взятый материал должен быть исследован немедленно в нативном состоянии, поскольку трепонемы легче обнаруживаются, пока они живые, благодаря их характерным движениям.

Исследование проводят с сухой системой (объектив 40, окуляр 10). При просмотре тканевой жидкости в темном поле видно большое количество светящихся точек, находящихся в движении (молекулярное броуновское движение), определяются также отдельные клетки и элементы крови. Если эритроцитов много, то они закрывают трепонемы, которые становятся плохо видными. На темном фоне бледная трепонема имеет вид тонкой нежной серебристой спирали, совершающей плавные маятникообразные движения, изредка трепонемы могут изгибаться под углом.

Микроскопия бледной трепонемы в темном поле является высокочувствительным и высокоспецифичным методом (75% и 80% соответственно) и является важным диагностическим инструментом. Следует иметь в виду, что попытки самолечения в виде приема антибактериальных препаратов или смазывания очагов дезинфицирующими растворами и различными мазями, которые практически всегда предпринимаются больными перед посещением врача, снижают вероятность обнаружения бледной трепонемы. Ценность метода также снижается при исследовании очагов поражения в полости рта и прямой кишке, из-за необходимости дифференцировки бледных трепонем со спирохетами-комменсалами — Т. buccalis, Т. refringens, Т. phagedenis и др.

Бактериоскопическая, бактериологическая диагностика возбудителя сифилиса (Treponema pallidum)
Выявление бледных трепонем при помощи реакции прямой флюоресценции. Округлые элементы - эритроциты.

б) Прямая иммунофлюоресценция бледных трепонем. Результат микроскопического исследования T.pallidum в темном поле зависит от многих обстоятельств: квалификации клинициста и технического персонала, разрешающих возможностей оптических инструментов и опыта врача-лаборанта, который должен не только обнаружить бледную трепонему, но и отличить ее от непатогенных спирохет. В конце 60-х гг. прошлого века был предложен метод прямой флюоресценции с применением меченых красителем противотрепонемных антител. Этот метод прост в техническом плане и не требует столь высокой подготовки, как для проведения микроскопии в темном поле; кроме того, он более безопасен для медицинского персонала, поскольку идентифицируемые в мазках трепонемы уже фиксированы. Преимуществом данного метода является также то, что просмотр материала может производиться в любое время после его взятия, поэтому необходимости в сохранении трепонем живыми нет. Поскольку светящиеся конъюгаты антител специфичны только для патогенных тре-понем, материал для исследования может быть взят из полости рта или прямой кишки; дальнейшей дифференцировки с вульгарными трепонемами не требуется.

Флюоресцентные моноклональные антитела могут применяться для выявления патогенных трепонем, как в мазках серозного отделяемого сифилидов, так и в тканевых срезах у пациентов с кожными проявлениями сифилиса, поражениями лимфатических узлов и различных органов. При обычных исследованиях серозную жидкость, отделяемую из язвы или эрозии, наносят на предметное стекло, высушивают, фиксируют метанолом или ацетоном и затем обрабатывают противотрепонемными моноклональными или поликлональными антителами, конъюгированными с флюоресцирующим красителем (флюоресцеин-изотиоцианатом). После отмывки препараты высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Покрытые светящимися антителами бледные трепонемы неподвижны, их светящиеся контуры различаются в ультрафиолете достаточно четко. Специфичность метода — 80%. При строгом соблюдении всей процедуры и условии, что больной не применял наружных антибактериальных препаратов, чувствительность прямой иммунофлюоресценции трепонем достигает 95%. В связи с отсутствием препарата коммерческих флюоресцентных моноклональных антител данный метод не введен в перечень обязательных методов диагностики в Российской Федерации.

в) Полимеразная цепная реакция. В последние годы появились принципиально новые молекулярно-биологические методы (полимеразная, лигазная цепные реакции), позволяющие проводить прямую идентификацию различных микроорганизмов, включая и бледную трепонему. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет большую ценность, так как позволяет выявлять не только единичные трепонемы, но даже их фрагменты. Это особенно важно при диагностике врожденного и нейросифилиса, когда серологические методы могут быть не эффективными. Объектом для исследования может быть серозная тканевая жидкость, пунктат лимфоузлов, спинномозговая жидкость, а также гомогенаты тканей внутренних органов (биопсийный или аутопсийный материал), подвергнутые специальной пробоподготовке. В техническом отношении подготовка биопроб к исследованию при помощи ПЦР является достаточно сложной процедурой, отнимающей много времени. Кроме того, до настоящего времени, методика ПЦР для диагностики бледной трепонемы не регламентирована, реакция имеет преимущественно исследовательский статус.

Бактериоскопическая, бактериологическая диагностика возбудителя сифилиса (Treponema pallidum)
Сифилис желудка. Импрегнация 'Г. pallidum в слизистом слое серебром по Стейнеру; увеличение 250. а - фрагмент препарата - скопление бледных трепанем.

г) Морфологическая диагностика сифилиса. В ряде случаев для решения диагностических задач необходимо визуализировать Т. pallidum в тканях. Методы морфологической идентификации бледной трепонемы были предложены давно, но использовались относительно редко не только по техническим причинам, но и в связи с определенными затруднениями в интерпретации полученных данных.

Стабильность метода импрегнации серебром по Левадити и Стейнеру во многом зависит от качества используемых реактивов и соблюдения температурного режима при проведении реакции. Фоновая реакция или недостаточное окрашивание трепонемы могут приводить к диагностическим ошибкам. Визуализацию микроорганизмов затрудняет то, что серебром окрашиваются гранулы меланина, ретикулиновые волокна, а также сапрофитные трепонемы и другие микроорганизмы, что требует проведения контрольного окрашивания по Граму.

В последние годы значительное распространение получили иммуногистохимические (ИГХ) методы с использованием моноклональных антител к Т. pallidum: авидинобиотиновый пероксидазный комплекс, непрямой иммунопероксидазный и иммуноалкалинофосфатазный методы.

Возможности ИГХ позволяют установить диагноз в тех сложных случаях, когда другими методами идентифицировать бледную спирохету не удается, что особенно актуально при диагностике кожных проявлений вторичного сифилиса, сифилитического гастрита, врожденного сифилиса, нейросифилиса, сифилиса у ВИЧ-инфицированных. Возможности использования методов ИГХ ограничены в связи с отсутствием коммерческих моноклональных антител.

д) Оценка чувствительности бледной трепонемы к антибиотикам. Отсутствие возможности культивирования бледных трепонем не позволяет проводить исследования по определению их чувствительности к антибиотикам. Предложение использовать для этих целей реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) не получило распространения из-за технических и организационных трудностей. Доказано существование плазмид в ядре трепонемы, что создает предпосылки для формирования генетически закрепленной устойчивости к пенициллину. Однако данных, свидетельствующих о существовании устойчивых к пенициллину штаммов трепонем, нет. Следует признать, что за более чем 60-летний период применения пенициллина для лечения сифилиса дозы антибиотика многократно возросли, что может быть косвенным показателем снижения чувствительности трепонемы к пенициллину.

Имеются также клинические наблюдения неудач лечения сифилиса эритромицином и азитромицином, что, по-видимому, свидетельствует о существовании устойчивых к этим антибиотикам штаммов трепонем. В связи с этим нельзя исключить вероятности появления в будущем аналогичных штаммов бледных трепонем, резистентных к пенициллину.

- Читать далее "Серологическая диагностика сифилиса"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 5.2.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.