Серологическая диагностика сифилиса

Основной методологией диагностики сифилиса являются непрямые серологические методы, определяющие присутствие антител в сыворотке, цельной крови и спинномозговой жидкости пациента, инфицированного бледной трепонемой. Важность серологической диагностики сифилиса обусловлена следующими факторами:

- серологические реакции являются единственным диагностическим инструментом при постановке диагноза скрытого сифилиса;

- серологические реакции являются единственным критерием эффективности лечения;

- серологические реакции являются решающими для юридического оформления диагноза при манифестных формах сифилиса.

Серологические методы диагностики делятся на нетрепонемные и трепонемные. Принципиально процедура серологической диагностики сифилиса основана на одновременном использовании нетрепонемных и трепонемных тестов. В соответствии с приказом М3 РФ №87 2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» виды серологических реакций, рекомендуемые для практического использования, строго регламентированы. Результаты серологических реакций могут быть качественными — положительный (+) или отрицательный (-) и полуколичественными, позволяющими судить об относительном количестве антител.

Устанавливается это путем визуального определения титра антител или инструментально — по оптической плотности образцов с расчетом коэффициента позитивности. Очевидно, что оба метода позволяют сделать лишь приблизительные оценки, поскольку не учитывается ряд факторов, как, например, аффинность антител и различие спектров классов антител в конкретном образце. Однако, по сравнению с ранее существующими методами визуального учета титров антител (РСК), данный подход имеет значительные преимущества. Титр антител устанавливается путем последовательных двукратных разведений сыворотки, давшей положительную реакцию. Титр показывает наибольшее разведение, сохраняющее позитивность.

Коэффициент позитивности рассчитывается, как частное отделения оптической плотности исследуемого образца на критическую плотность. Критическая плотность — это среднее значение оптической плотности отрицательного контроля с учетом дополнительных коэффициентов, взятых из приложенной инструкции. Различия показателей оптической плотности в пределах 0,8-0,9 до 1,1-1,2 от значения критической называют «серой зоной». Значения, расположенные выше этой зоны, оцениваются, как положительные, а ниже, — как отрицательные. Любой первоначально полученный сомнительный или положительный результат серологического исследования на сифилис подлежит обязательному повторению через 7-10 дней с новой порцией крови.

а) Нетрепонемные реакции позволяют определять так называемые ранние антитела (реагины) против липидных антигенов, которые являются общими для бледной трепонемы и для тканей хозяина (организма человека). Реактивность нетрепонемных тестов может быть следствием не только присутствия в организме возбудителя сифилиса, но и повреждения тканей хозяина. И хотя нетрепонемные реакции не всегда специфичны в отношении сифилиса, простота выполнения способствовала их широкому применению в качестве отборочных для установления предварительного диагноза сифилиса. Нетрепонемные тесты используются для первичного скрининга (отбора), оценки качества проведенного лечения, а также дифференциального анализа положительных результатов трепонемных реакций.

К реакциям этого типа относятся: реакция микропреципитации (РМ11), быстрый плазмореагиновый тест (RPR, VDRL - Veneral Disease Research Laboratory, англ.) и др.

Реакция микропреципитации (РМП) основана на образовании осадка (преципитата), образующегося при добавлении к плазме или сыворотке больного сифилисом эмульсии препарата кардиолипинового антигена, выпадающего в виде хлопьев беловатого цвета.

Быстрый плазмореагиновый тест (RPR) относится к флокуляционным, он определяет наличие в крови больного антител к кардиолипину, холестерину и лецитину, сорбированным на мелкодисперсных частицах угля. Результаты теста определяются по агрегации черных частиц угля. Преимуществом RPR-теста является то, что он наиболее стандартизирован, это позволяет получать стабильные, воспроизводимые и сравнимые результаты. Чувствительность RPR-теста при первичном сифилисе — 85%, вторичном — 100%, раннем скрытом — 98%, позднем — 95%.

Нетрепонемные тесты выполняются в полуколичественном варианте и являются весьма важным, а при скрытых формах единственным критерием эффективности проведенного лечения: уменьшение титра антител в 4 и более раз в течение года является признаком эффективного лечения. У 95-98% больных ранними формами сифилиса в разные сроки после адекватного лечения нетрепонемные тесты становятся стойко отрицательными.

В течение почти 70 лет основным инструментом для серологической диагностики сифилиса в Советском Союзе служила реакция связывания комплемента (РСК) с кардиолипиновым (реакция Вассермана — РВ) и трепонемным антигенами. Вместе с реакцией микропреципитации (РМП) оба вида РСК были объединены в так называемый «комплекс серологических реакций» — КСР. При первичном сифилисе РВ становится положительной на 6-й неделе заболевания у 25-50% больных, а на 7-8-й неделе — у 75-90%. Мри вторичном сифилисе у подавляющего числа больных (98-100%) регистрируется положительная РВ.

В последующие сроки в зависимости от длительности заболевания позитивность серологических реакций убывает: при раннем скрытом сифилисе — 90-95%, позднем — 80%, третичном — 60-70%. Однако РСК обладает и достаточно существенными недостатками: низкая чувствительность и специфичность; технологические трудности; невозможность стандартизации диагностического процесса и как следствие плохая воспроизводимость результатов; субъективизм при оценке результатов реакции; зависимость результатов не только от профессионального, но и психоэмоционального состояния технического персонала и т.д.

Поэтому начиная с 2006 г. реакция Вассермана выведена из комплекса скрининговых и диагностических реакций на сифилис. Из нетрепонемных реакций для этих целей оставлены реакция микропреципитации (РМП) или плазмореагиновый тест (RPR).

Однако положительные результаты только нетрепонемных тестов не могут быть основанием для постановки диагноза сифилиса, их необходимо подтверждать данными трепонемных реакций. Это связано с тем, что при определенных состояниях организма (системные и онкологические заболевания, беременность, туберкулез, обширные раневые инфекции и т.д.) нетрепонемные реакции могут быть положительными при отсутствии специфической инфекции. Эти так называемые биологические ложно-положительные реакции на сифилис отличить от истинных можно только при помощи трепонемных реакций.

Серологическая диагностика сифилиса

б) Трепонемные реакции позволяют определять антитела к антигенам бледной тренонемы, в связи с чем данные реакции являются более специфичными и чувствительными. К трепонемным реакциям относятся: реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Наиболее стандартизированными, воспроизводимыми, высокочувствительными и специфичными являются РИГА и ИФА. Реакции этого типа являются обязательными для подтверждения диагноза, но могут применяться и в качестве отборочных. После проведенного лечения трепонемные тесты могут сохранять позитивность в течение долгого времени, а иногда в течение всей жизни.

Поэтому для понимания ситуации (новое заражение, состояние после лечения) одновременно с трепонемными применяются и нетрепонемные тесты.

Реакция непрямой гемагглютинации. Это трепонемный тест, предназначенный для выявления в сыворотке крови специфических антител к антигенам бледной трепонемы методом гемагглютинации. Принцип метода заключается в агглютинации птичьих эритроцитов, сенсибилизированных антигенами бледной трепонемы (штамм Никольс), специфическими противотрепонемными антителами испытуемой сыворотки. При первичном сифилисе реактивность РНГА наступает несколько позже, чем нетрепонемного РПР-теста. При вторичном, скрытом и позднем сифилисе чувствительность и специфичность РНГА приближается к 100%. Имеется возможность автоматизации лабораторного процесса и объективизации полученных данных.

В настоящее время выпускается оборудование, обеспечивающее автоматизированный анализ изображений РНГА с возможностью их количественной оценки, визуализации на мониторе и архивирования. После адекватного лечения РНГА может сохранять реактивность в течение длительного времени, а иногда пожизненно. Результаты РНГА определяются, как «положительный/отрицательный», указание титров положительных реакций не является обязательным.

Иммуноферментный анализ. Принцип реакции заключается в том, что к образованному комплексу антиген (нанесен на твердофазный носитель)-антитело (испытуемая сыворотка) добавляют антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с ферментными маркерами. В случае положительной реактивности присоединившийся к комплексу антиген-антитело фермент разлагает добавленный в систему субстрат с образованием цветной реакции различной интенсивности. Это так называемый непрямой метод ИФА. Помимо него существуют ловушечные методы для суммарного и раздельного определения иммуноглобулинов.

Метод ИФА обладает высокими чувствительностью и специфичностью, может быть автоматизирован и использоваться одновременно для обследования больших контингентов. Результат реакции выражают как «положительный» или «отрицательный», указание титра реакции не обязательно, поскольку изменение этого показателя не является критерием эффективности лечения.

Реакция иммунофлюоресценции. Антигеном в этой реакции являются живые патогенные трепонемы штамма Никольса. Зафиксированный на стекле антиген обрабатывается исследуемой сывороткой. В отличие от ИФА в этой реакции специфический комплекс антиген-антитело обрабатывают антителами, меченными флюорохромом, которые направлены против иммуноглобулинов человека. При просмотре в люминесцентном микроскопе образующийся комплекс антиген-антитело дает характерное свечение, по степени которого судят о позитивности реакции. Наиболее чувствительным является вариант РИФабс, т.е. использование сыворотки, предварительно обработанной сорбентом для удаления групповых антител.

РИФ считается одной из лучших диагностических реакций на сифилис, что обусловлено высокими показателями чувствительности, специфичности, а также возможностью эффективного использования на протяжении всего времени развития инфекции. Безусловным достоинством РИФ является возможность определения трепонемоспецифических IgM, относящихся к ранним маркерам инфекции; их появление может быть зафиксировано уже в инкубационном периоде. Но наибольшее значение имеет определение IgM для диагностики врожденного сифилиса: наличие трепонемоспецифических IgM в крови ребенка свидетельствует о врожденном сифилисе, так как подобные иммуноглобулины матери не проникают через плацентарный барьер. РИФ применяется также для дифференциальной диагностики ложноположительных реакций и ретроспективной оценки перенесенной инфекции.

Серологическая диагностика сифилиса
Изменение позитивности серологических реакций в различные периоды развития сифилитической инфекции.

в) Подтверждение серологических тестов на сифилис. Последним достижением в серологической диагностике сифилиса является реакция линейного иммуноблоттинга, которая используется для подтверждения положительных результатов трепонемных тестов (ИФА, РИГА, РИФ). Реакция позволяет полуколичественно оценить интенсивность антительного ответа (антитела классов IgG, IgM) к отдельным иммунодоминантным эпитопам бледной трепонемы:

- TpN47, TpN17, TpN15 — пептиды Т. pallidum штамма Никольса, экспрессированные в Е. coli;

- TmpA — синтетический пептид трансмембранного белка А.

Указанные антигены вместе с иммобилизованными IgG человека (контроль) нанесены на полоски целлюлозы. Для исследования используется сыворотка или плазма в объеме 10 мкл. После инкубации в течение 12-16 ч при комнатной температуре результаты реакции выявляют при помощи иммуноферментного анализа с использованием сыворотки против IgG человека, меченной щелочной фосфатазой. Для оценки результатов сравнивают интенсивность окрашенных линий антигенов с контролем. Линейный иммуноблоттинг демонстрирует наиболее высокие показатели чувствительности и специфичности во всех периодах сифилиса. Очевидно, что это один из наиболее высокочувствительных и специфичных из известных в настоящее время трепонемных тестов.

По аналогии с ВИЧ-инфекцией и вирусными гепатитами предполагается использовать данный тест как подтверждающий, в том числе для диагностики врожденного сифилиса, сифилиса у беременных, больных коллагенозами, онкологических больных, при расхождении результатов трепонемных тестов, а также в случаях, требующих специальных экспертных оценок.

Трудности серологической диагностики сифилиса связаны с рядом обстоятельств. Следует иметь в виду, что положительная реактивность трепонемных и нетрепонемных тестов еще не является окончательным решением вопроса диагноза сифилис. Положительные тесты на сифилис могут быть вызваны иными причинами (заболеваниями); кроме того, они могут свидетельствовать о перенесенной в прошлом и пролеченной инфекции. Это особенно важно при диагностике скрытых форм сифилиса, когда данные серологических исследований являются решающими для постановки диагноза. С другой стороны, отрицательная реактивность не всегда означает отсутствие инфекции в организме.

Данная ситуация — достаточно редкая, она может возникнуть как на самых ранних этапах развития инфекции (период инкубации), так и при поздних формах. Во избежание диагностических ошибок, связанных с ложноположительными и отрицательными результатами, на практике одновременно используют не одну, а несколько серологических реакций. Необходимость подобного подхода объясняется тем, что, с одной стороны, диагностические реакции, связанные с идентификацией инфекционных агентов, характеризуются неодинаковой чувствительностью и специфичностью, а с другой, — образование различных классов иммуноглобулинов (антител) происходит не одновременно.

г) Методы экспресс диагностики сифилиса. Экспресс методами диагностики сифилиса являются методы прямого обнаружения бледной трепонемы — микроскопия в темном поле и прямая иммунофлюоресценция, а также серологические нетрепонемные методы — реакция микропреципитации (РМП), плазмореагиновый тест (RPR), реакции типа VDRL

- Читать далее "Лечение и профилактика сифилиса"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 5.2.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.