После публикации К. Н. Schleifer и R. Klipper-Balz (1984), подтвердивших существование рода Enterococcus, в начале представленных только штаммами Е. faecalis и Е. faecium, было предложено включить в этот род и другие известные уже к тому времени виды. Все вновь выделенные штаммы были описаны на основании экспериментов с использованием метода ДНК-ДНК-гибридизации, считающегося «золотым стандартом», и он был применен для большинства видов рода Enterococcus. Установление нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК также является очень важным методом в дополнение к описанию бактериальных видов.

В настоящее время известны 27 достаточно полно охарактеризованных видов, включенных в род Enterococcus. Они представлены в таблице ниже, где приводится 11 фенотипических характеристик, по которым они первоначально идентифицированы на видовом уровне. Правильная идентификация грамположительных каталазоотрицатильных штаммов в качестве Enterococcus может быть выполнена, если будет показано, что неизвестный штамм является положительным по ЖЭ-, ПИР-и ЛАП-тестам и также может расти в присутствии 6,5 % NaCl и при 45°С. Но в отношении штаммов Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus и Vagococcus с фенотипически сходными характеристиками, ошибочно идентифицированных как Enterococcus, требуется полная идентификация до видового уровня.

Подтверждение присутствия антигена группы D с использованием серологических реакций может быть полезно при идентификации энтерококков, хотя этот ан тиген определяется только у 80 % этих штаммов. С другой стороны, штаммы Pediococcus и Leuconostoc, так же как и штамм Vagococcus, могут реагировать с антисывороткой группы D.

Метод AccuProbe также может быть использован для установления принадлежности неизвестных штаммов к роду Enterococcus. Этот метод основывается на ДНК-олигомере, имеющем структуру, комплементарную к сегменту энтерококковой рРНК. Большинство штаммов известных видов энтерококков положительно реагируют в этой пробе. Правда, штамм Vagococcus при использовании этого теста проявляет себя также положительно. Когда установлено, что неизвестный каталазоотрицательный грамположительный кокк является представителем рода Enterococcus или близко родственным видом (Lactococcus и Vagococcus), то тесты, описанные в таблице ниже, также могут быть использованы для их видовой идентификации.

Выявление в последние годы различных фенотипических вариантов штаммов Е. faecium, Е. faecalis, Е. casseliflavus и Е. gallinamm, и филогенетически родственных родов Lactococcus и Vagococcus, выделенных от людей, так же, как и несколько новых описанных видов, делает необходимым расширить схему их видовой идентификации.

Это очень важно для получения недостающей информации о фенотипических характеристиках штаммов Enterococcus, Lactococcus и Vagococcus, выделенных не от людей, а от домашних птиц и животных, поскольку такие характеристики могут обладать рядом существенных особенностей.

Энтерококки, представленные в таблице ниже, можно разделить на 5 физиологических групп, основываясь данных об образовании кислоты из сорбита и о гидролизе аргинина. Все тесты, упомянутые в таблице, являются общепринятыми пробирочными тестами. Виды, относящиеся к каждой группе, были идентифицированы по данным дополнительного тестирования. Группирование здесь основывается на главных фенотипических характеристиках, так что нет необходимости прибегать к анализу нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК или к другим молекулярным методам. Принадлежность штамма к той или иной группе может быть установлена в условиях любой лаборатории, где проводится идентификация энтерококков до видового уровня.

Такое определение энтерококков быстрой назвать нельзя, так как иногда может потребоваться 10-дневная инкубация исследуемых штаммов. Однако большую часть идентификационных тестов можно провести на протяжении двухдневной инкубации.

Группа I включает в себя штаммы Е. avium, Е. malodoratus, Е. pseudoavium, Е. raffinosus, Е. saccharolyticus, Е. gilvus и Е. pallens. Эти виды энтерококков образуют кислоту из сорбита, но не гидролизуют аргинин. Их дифференцируют с использованием тестов с арабинозой и раффинозой, а также по их способности утилизировать пируват и неспособности образовывать пигмент. Образование кислоты из метил-α-D-глюкопиранозида (МГП) также помогает отличить некоторые виды друг от друга.

Группа II представлена Е. faecalis, Е. faecium и совсем недавно описанными видами Е. casseliflavus, Е. gallinarum, Е. mundtii и Е. haemoperoxidus. Эти виды образуют кислоту из маннита и гидролизуют аргинин, но не образуют кислоты из сорбита. Встречаются атипичные штаммы, которые неспособны гидролизовать аргинин и образовывать кислоту из маннита. Lactococcus sp. также отнесен к этой группе, потому что фенотипические характеристики некоторых штаммов этого рода могут приводить к неправильной их идентификации в качестве энтерококков.

Если неподвижные варианты штаммов Е. casseliflavus и Е. gallinarum неправильно определены, то тест, включающий образование кислоты из МГП, может использоваться, чтобы помочь в идентификации этих видов, в то время как штаммам Е. faecium и Е. faecalis это не поможет. По всей вероятности, положительные по образованию кислоты из маннита штаммы Е. haemoperoxidus, представляющие недавно описанный вид, также будут отнесены к группе II.

Группу III образуют штаммы энтерококков, гидролизующие аргинин, но не образующие кислоту из маннита или сорбита. Эту группу представляют штаммы Е. dispar, Е. durans, Е. hirae и два новых вида — Е. ratti и Е. villorum (Е. porcinus). Новые виды в этой группе трудно идентифицировать и отличить от Е. durans. Штаммы Е. durans, Е. ratti и Е. villorum имеют очень сходные фенотипические профили в тестах, представленных в таблице ниже. Их можно дифференцировать в реакциях с лакмусовым молоком, по тесту гидролиза гиппурата и по образованию кислоты из трегалозы и ксилозы.

Штаммы Е. durans образуют кислоту и сгусток в лакмусовом молоке, Е. villorum образует кислоту, но не образует сгустка, Е. ratti не образует ни кислоты, ни сгустка в реакции с лакмусовым молоком и вариабелен в тесте с гидролизом гиппурата. Е. durans образует кислоту из трегалозы, но не образует ее из ксилозы. Е. villorum образует кислоту из трегалозы и из ксилозы, а Е. ratti не образует кислоты ни с одной из них.

Другие представители этой группы легко идентифицируются в реакциях с пируватом и арабинозой, раффинозой и сахарозой. Необычные маннит-отрицательные варианты штаммов Е. faecalis и Е. faecium имеют сходство с видами энтерококков, входящих в эту группу. Однако штаммы Е. faecalis положительно проявляются в тесте с пируватом, но не образуют кислоту в тесте с арабинозой, раффинозой и сахарозой, а Е. faecium образует кислоту в тесте с арабинозой.

Отрицательный по манниту, недавно описанный вид энтерококков Е. haemoperoxidus, может быть дифференцирован от других видов энтерококков с помощью тест-системы API.

Группа IV. Представители этой группы энтерококков включают четыре вида (Е. asini, Е. cecorum, Е. phoeniculicola, Е. sulfureus), которые не образуют кислоты в тесте с маннитом или сорбитом и неспособны гидролизовать аргинин. Эти четыре вида дифференцированы по образованию кислоты в тестах с арабинозой, раффинозой и сорбитом в тесте образования пигмента, а штаммы Е. phoeniculicola и Е. sulfureus — по тесту образования ими кислоты в тесте с МГП.

Группу V представляют виды энтерококков: Е. canis, Е. columbae, Е. moraviensis, а также Vagococcusfluvialis. Различные штаммы Е. casseliflavus, Е. gallinarum и Е. faecalis, которые не гидролизуют аргинин, имеют сходство с микроорганизмами, включенными в эту группу. Однако эти варианты имеют характеристики, сходные с видами, гидролизующими аргинин и могут быть дифференцированы с помощью тех же самых фенотипических тестов. Vagococcus fluvialis представлен в этой группе потому, что его фенотипические характеристики очень схожи с таковыми рода Enterococcus, и некоторые штаммы могут быть идентифицированы по схемам, предложенным для этого рода. Е. moraviensis, как и любой вновь описанный вид этого рода, может попасть в группу V энтерококков, но при сходстве результатов Е. moraviensis будет легко отличим от других энтерококков группы V в API тесте.

Существует несколько коммерческих доступных миниатюрных, ручных, полуавтоматических и автоматических тестов, рекомендованных для идентификации штаммов энтерококков. В общем, эти системы оказались надежными для идентификации штаммов Е. faecalis и в меньшей степени — Е. faecium. Точная идентификация других видов с помощью большинства тест-систем зависит от дополнительного тестирования, хотя совершенствование их сводилось к использованию модернизированных систем, заложенных в банке генов. Коммерческие системы, пригодные для идентификации штаммов различных видов энтерококков: API 20S и API Rapid ID32 STREP («bioMerieux, Hazelwood», МО, США), Crystal gram + и Crystal Rapid gram + идентификационные системы («Becton Dickinson Microbiology Systems»), gram + идентификационная Card of the Vitek система (bioMerieux) и gram + идентификационная панель MicroScan Walk/Away система («Dade MicroScan», «West Sacramento», CA, США).

Точная идентификация с помощью некоторых из этих систем в сравнении с идентификацией молекулярными методами была представлена S. Angeletti et al. в 2001 году.

В общем, с помощью любой из этих систем удается точно идентифицировать приблизительно 80% выделенных штаммов энтерококков. Идентификация необычных видов энтерококков, выявленных с помощью коммерческих тест-систем, должна быть проведена стандартным молекулярным методом, прежде чем сообщить о полученных результатах. Назовем некоторые из них:
• профилей белков цельноклеточных лизатов патогенных микроорганизмов (ПБЦЛ) в электрофорезе;
• вибрационно-спектроскопический анализ;
• проточно-магнетический резонансно-специфический анализ;
• секвенирование гена 16S рРНК;
• широкий спектр ПЦР.

Первый из перечисленных методов позволяет проводить дифференциацию и идентификацию близкородственных микроорганизмов, даже если они принадлежат к одному и тому же виду. Метод заключается в электрофоретическом разделении полученных лизатов в додецил-сульфат-полиакриламидном геле. Электрофореграмма позволяет определить набор белков в лизате, что является основанием для дифференциации и определения видовой принадлежности анализируемых микроорганизмов, что должно найти практическое применение в клинических лабораториях для анализа выделенных патогенов.

В настоящее время метод широко применяется для определения вновь выделенных и неизвестных штаммов энтерококков до видового уровня. Он зарекомендовал себя как надежный и суперспецифичный инструмент дифференциации и идентификации не только типичных, но и атипичных штаммов энтерококков.

Метод получил высокую оценку и широко рекомендуется для проведения генетических исследований. Выявленные при его использовании незначительные количественные или качественные различия среди штаммов, принадлежащих к каждому из родственных видов Lactococcus и Vagococcus, хорошо коррелируют с данными, полученными методом ДНК-ДНК-гомологии.

Для всех видов энтерококков были изучены нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК, что позволило проанализировать их с помощью Банка генов.

- Читать далее "Определение чувствительности энтерококков (Enterococcus spp.) к антибиотикам"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 29.3.2020