Методика проведения реакции двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (О. Ouchterlony, 1948)

На предметное стекло наносят тонким слоем агаровый гель, в котором делают лунки. Одну лунку заполняют антигеном, другую — антителом. Диффузия компонентов реакции происходит во всех направлениях, молекулы антигена и антитела движутся радиально в толще агара из пространственно разделенных лунок, и в месте встречи образуют одну или несколько линий преципитата в виде белых полос.

Для постановки реакции неодходимо иметь:
— антигены-преципитиногены;
— преципитирующую антисыворотку;
— агар Дифко или Нобля («Difco», США) или агарозу;
— 0,01 М фосфатно-солевой буфер pH 7,2,
— нормальную сыворотку кролика;
— натрия азид 1% («Serva», Германия);
— стандартный штамп диаметром 4 мм;
— водяной насос;
— предметные стекла размером 2,5-7,5 см;
— микропипетки;
— градуированные и пастеровские пипетки;
— влажную камеру.

Методика проведения реакции двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (О. Ouchterlony, 1948)
Реакции преципитации:
а — реакция кольцепреципитации по Асколи: 1 —опыт, 2 —контроль;
б — реакция преципитации в геле (по Оухтерлони): 1— исследуемый антиген, 2 —известный антиген (положительный контроль), 3 —нормальная сыворотка (отрицательный контроль), 4 —иммунная сыворотка;
в — реакция иммунодиффузии в геле: PI — исследуемый антиген, 1, 2, 4, 6 — иммунные сыворотки от разных продуцентов, 5, 8 —нормальные сыворотки (отрицательный контроль).

а) Техника постановки. На предметные стекла размером 2,5 х 7,5 см наносят 3 мл расплавленного агарового геля следующего состава: 1,5-2,0% агарозы или агара Дифко («Difco», США) в 0,01 М ФСБ pH 7,2, натрия азид в конечной концентрации 0,05%. В застывшем геле стандартным штампом просекают контуры 7 лунок диаметром 4 мм (одна в центре, 6 — на периферии) на расстоянии 4 мм друг от друга.

Агаровые пробки периферических лунок (на расстоянии 4 мм друг от друга) удаляют при помощи водяного насоса. Для определения гомологичности иммунной сыворотки и исследуемых антигенов в центральную лунку заливают преципигирующие антитела, в 1-4-ю периферические — антигены по 25 мкл. Для контроля в 5-ю лунку вносят заведомо гомологичный антиген (положительный контроль), в 6-ю—0,01 М ФСБ pH 7,2 (отрицательный контроль).

Если по условиям эксперимента необходимо выявить наличие типо- или родоспецифических связей между антигеном и несколькими исследуемыми иммунными сыворотками (гомо- и гетерологичными), то в центральную лунку вносят испытуемый антиген, а в периферические—различные преципитирующие антитела. В одну контрольную лунку помещают нормальную сыворотку (отрицательный контроль), в другую — известную сыворотку, гомологичную антигену (положительный контроль).

Стекло помещают во влажную камеру и инкубируют при комнатной температуре в течение суток.

б) Учет результатов проводят при ярком освещении. Определяют интенсивность, форму и протяженность линий преципитации между центральной и периферическими лунками. Для удаления неспецифического преципитата, который иногда появляется вокруг лунок, стекло рекомендуется поместить на 1 ч в 10% раствор натрия хлорида. Анализ расположения линий преципитации позволяет судить об иммунохимическом родстве или различии исследуемых антигенов.

- Читать далее "Методика проведения простой (одиночной) радиальной иммунодиффузии по Манчини"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.