Методика проведения реакции иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция иммунофлюоресценции прямая (РИФ) используется как метод экспресс-диагностики для выявления антигена в исследуемом материале от больных. Впервые предложен Coons и соавторами в 1942 г. Метод состоит в обработке фиксированного на стекле материала, содержащего антиген, гомологичной иммунной сывороткой, конъюгированной с флюорохромом (флюоресцеинизотиоизоционатом — ФИТЦ, производными родамина). Медицинской промышленностью выпускаются наборы флюоресцирующих иммуноглобулинов лошадиной (кроличьей и др.) сыворотки против антигенов различных микроорганизмов. Обработанный такой сывороткой препарат выдерживают при температуре 37 ° С во влажной камере в течение 15-30 мин. После промывания его высушивают на воздухе и микроскопируют в люминесцентном микроскопе (ЛЮМ). В положительных случаях по периферии объекта появляется светящаяся кайма зеленого цвета.

Недостатком метода является необходимость получения большого количества стандартных люминисцирующих сывороток против различных микроорганизмов.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) основана на применении антиглобулиновой (антивидовой) сыворотки, меченной флюорохромом (Weller, Coons, 1954). Она ставится в два этапа. На первом этапе фиксированный антиген обрабатывают обычной иммунной сывороткой при температуре 37 °С во влажной камере в течение 30-60 мин. Препарат промывают и высушивают. На втором этапе к прореагировавшему иммунному комплексу добавляют каплю лю-минесцирующей сыворотки против глобулинов того вида животного, сыворотка которого была применена на первом этапе. Выдерживают 20-30 мин в тех же условиях. Снова промывают, высушивают и микроскопируют. Результат оценивают, как и при РИФ. Эта методика может быть использована и для выявления антител.

Медицинской промышленностью подготовлены и выпускаются тест-системы для обнаружения антител в РНИФ. Они включают:
— предметные стекла с фиксированным инактивированным известным антигенсодержащим материалом;
— лиофилизированную иммунную сыворотку человека, гомологичную антигену (для положительного контроля);
— лиофилизированную контрольную нормальную сыворотку человека;
— лиофилизированную люминесцирующую сыворотку (ФИТЦ—конъюгат) против глобулинов человека;
— фосфатно-солевой буфер (ФСБ) pH 7,2-7,4;
— изотонический раствор натрия хлорида;
— дистиллированную воду.

Контрольные сыворотки растворяют в 0,2 мл дистиллированной воды и доводят ФСБ до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы.

ФИТЦ-конъюгат растворяют в 0,25 мл дистиллированной воды и доводят ФСБ до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы.

Антигенсодержащие предметные стекла предварительно промывают дистиллированной водой в течение 2 мин и высушивают при комнатной температуре. Готовят двухкратные разведения исследуемой сыворотки крови людей, каждое из которых наносят по 1 капле (0,25 мл) на отдельное «пятно» антигена. Для контроля рядом наносят:
— контрольную иммунную сыворотку, гомологичную антигену;
— контрольную нормальную сыворотку.

Препараты помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 30 мин или при 6(±2)°С в течение 18 ч. Затем препараты трехкратно по 3 мин выдерживают в изотоническом растворе, промывают дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре в течение 15 мин. На каждое «пятно», в том числе и «пятна» контрольных сывороток, наносят ФИТЦ-конъюгат против глобулинов человека в рабочем разведении по 1 капле (0,25 мл). Инкубируют во влажной камере при 37 °С в течение 30 мин, затем выдерживают трехкратно по 3 мин в изотоническом растворе, промывают дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре.

Исследуют препараты в люминесцентном микроскопе под водно-иммерсионным объективом (х40, х60). Интенсивность специфического свечения антигенсо-держащего материала оценивают по условной четырехплюсовой шкале:
++++ сверкающая интенсивная изумрудно-зеленая флюоресценция;
+++ ярко-зеленая флюоресценция;
++ отчетливое зеленое свечение;
+ тусклое зелено-серое свечение;
- свечение отсутствует.

Реакцию учитывают при отсутствии свечения с контрольной нормальной сывороткой и ярким свечением контрольной иммунной сыворотки.

Положительным считают пробу (разведение) с интенсивностью свечения ++ и больше.

- Читать далее "Реакции с использованием свидетелей: ИФА, РИА"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.