Реакция связывания комплемента (РСК) применяется для обнаружения антител в сыворотке крови или для выявления антигена в материале от больного. Эта реакция основана на том, что при взаимодействии антигена с антителом образуется комплекс, который адсорбирует (связывает) комплемент. Однако этот феномен протекает в пробирке без видимых проявлений. Для выявления результатов реакции в качестве индикаторной системы используют реакцию гемолиза. Таким образом, в РСК задействованы две системы: специфическая, в которой определяют возможность образования иммунного комплекса антитело + антиген + комплемент, и индикаторная—гемолитическая система, которая включает эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Проведение реакции делится на две фазы. В первую фазу проводят раздельную инкубацию специфического и индикаторного комплексов. Во вторую фазу смешивают указанные комплексы, что позволяет определить локализацию комплемента по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов. Так, если имеет место соответствие антигена и антитела, происходит связывание этим комплексом комплемента, а реакция гемолиза будет отрицательной, так как в системе отсутствует свободный комплемент. Если же соответствия между антигеном и антителом нет, комплемент свяжется с гемолитической системой, результатом чего будет гемолиз эритроцитов.

РСК широко применяется в диагностике инфекционных болезней — сыпного тифа, туберкулеза, сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде— Жангу), протозойных и вирусных инфекциях.

Для постановки реакции необходимы:
— исследуемая сыворотка, полученная путем венепункции;
— антиген;
— комплемент;
— эритроциты барана;
— гемолитическая сыворотка.

Подготовка ингредиентов для постановки РСК:

1. Сыворотку крови, полученную от больного путем венепункции, перед исследованием инактивируют прогреванием на водяной бане (в инактиваторе) при 56 °С в течение 30 мин. Перед постановкой реакции сыворотку разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:5 (0,1 мл сыворотки + 0,4 мл изотонического раствора).

2. Антигеном могут быть взвесь целых бактериальных клеток в дистиллированной воде или изотоническом растворе натрия хлорида, убитых нагреванием при 60 °С в течение 1 ч или при 100 °С в течение 15-20 мин, микробные полисахариды и белки, лизаты и экстракты из микробных культур, патологически измененных и нормальных тканей.

Предварительно определяют титр антигена для исключения его антикомпле-ментарности и гемотоксичности. Для этого готовят основное разведение антигена, содержащее 1 млрд, микробных тел в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида (по оптическому стандарту мутности). В ряд пробирок вносят несколько последовательно уменьшающихся доз основного разведения антигена от 0,5 до 0,05 мл, добавляют до 1 мл изотонический раствор и по 0,5 мл рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37 °С в течение 1 ч. После этого во все пробирки вносят по 1 мл смеси гемолитической системы (гемолитической сыворотки + эритроциты барана). Выдерживают 1 ч в термостате при той же температуре и проводят учет результатов.

Титром антигена считают наименьшую дозу, при которой прекращается задержка гемолиза и, следовательно, отсутствует его антикомплементарное действие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составляющую примерно 0,5-0,75 его титра.

3. Комплементом является смесь нативных сывороток, полученных от 3-5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах. Перед постановкой РСК комплемент титруют для определения наименьшего его количества (титр комплемента), которое вызывает гемолиз 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре.

Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 (0,1 мл комплемента + 0,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) и разливают в ряд пробирок в объеме от 0,05 до 0,5 мл. Доводят общий объем в пробирках изотоническим раствором до 1,5 мл и инкубируют в термостате при 37 °С в течение 45 мин. Затем добавляют в каждую пробирку гемолитическую смесь (0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре + 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана) в объеме 1 мл. Ставят 2 контроля:
— контроль гемолитической системы—1 мл гемолитической смеси + 1,5 мл изотонического раствора;
— контроль комплемента—0,5 мл основного разведения комплемента 1:10 + 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов + 1,5 мл изотонического раствора.

Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат на 30 мин. Определяют титр комплемента — минимальное количество, при котором еще происходит полный гемолиз эритроцитов.

При постановке РСК пользуются рабочей дозой комплемента, которая соответствует титру, увеличенному на 20-30% (это соответствует количеству комплемента в предпоследней пробирке (гемолиз).

Ниже приводится схема расчета приготовления рабочего раствора комплемента.

Пример. Рабочая доза комплемента равна 0,25 мл. Это значит, что в 0,25 мл основного разведения комплемента (1:10) содержится 0,025 мл нативной сыворотки морской свинки. Для постановки реакции, рассчитанной на 60 пробирок, требуется нативной сыворотки:

0,025 мл х 60 пробирок = 1,5 мл сыворотки

Это количество сыворотки разводят в 30 мл изотонического раствора натрия хлорида и разливают по 0,5 мл в опытные пробирки.

4. Гемолитическую сыворотку инактивируют прогреванием при 56 °С в течение 30 мин и используют в реакциях в тройном титре. Например, если титр такой сыворотки равен 1:1800, то в реакции используют разведение 1:600.

5. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови здорового животного в возрасте не менее 1 года. Эритроциты трижды отмывают в изотоническом растворе натрия хлорида с центрифугированием. При последнем промывании эритроцитов надосадочный слой жидкости должен быть совершенно прозрачным. К 3 мл отмытых эритроцитов добавляют 97 мл изотонического раствора и получают 3% взвесь, которую используют в реакциях.

Смесь равных объемов гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана называют гемолитической системой. Перед использованием ее выдерживают в термостате 30 мин.

Постановка диагностической РСК. Реакцию ставят в общем объеме 2,5 мл. Это соответствует количеству каждого ингредиента в дозе 0,5 мл. Рабочая доза каждого оттитрованного ингредиента содержится в объеме 0,5 мл. Реакция проводится в две фазы, каждая из которых — самостоятельная иммунологическая реакция.

Первая фаза. В одной пробирке смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки, антигена и комплемента в рабочих дозах, в другую — помещают 1 мл гемолитической смеси. Ставят 2 контроля:

— контроль комплемента (I) — исследуемая сыворотка + комплемент + изотонический раствор;

— контроль антигена (II) — антиген + комплемент + изотонический раствор.

Все пробирки выдерживают при 37 °С 1 ч или при комнатной температуре 18-20 ч.

Вторая фаза. В первую пробирку с основными компонентами реакции и в контрольные пробирки добавляют гемолитическую систему. Смесь всех компонентов реакции после энергичного встряхивания выдерживают в термостате 1 ч при тех же условиях.

Проводят учет результатов. В контрольных пробирках должно наблюдаться явление гемолиза, так как комплемент не был связан компонентами первой фазы. В опытной пробирке при соответствии антитела антигену происходит связывание комплемента и, следовательно, регистрируется задержка гемолиза.

Степень интенсивности реакции оценивают по четырехплюсовой системе:

++++ полная задержка гемолиза; жидкость бесцветна, значительный осадок эритроцитов;

+++ явная задержка гемолиза; жидкость слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов;

++ частичная задержка гемолиза; жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов;

+ слабая задержка гемолиза; жидкость интенсивно окрашена, осадок эритроцитов небольшой;

± следы задержки, почти полный гемолиз; осадок в виде облачка; полный гемолиз, «лаковая» кровь, отсутствие осадка.

Чувствительность РСК может быть повышена, если ее проводить не при 37 °С, а на холоду (при 4 °С в течение 18 ч).

- Читать далее "Методика проведения реакции иммунофлюоресценции (РИФ)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.08.2019