Приготовление растворов и реактивов для иммунологических исследований

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) pH 7,2-7,4 на тридистиллированной автоклавированной воде:
— 7 г натрия хлорида (NaCl);
— 2 г натрия фосфат двузамещенного (Na2НРO4);
— 0,3 калия фосфат однозамещенного (КН2НO4);
— вода дистиллированная (Н2O) до 1000 мл.

5-Кратный изотонический веронал-мединаловый буфер (pH 7,3-7,4) для титрования комплемента (по Kabat, Mayer, 1958):
— веронал — 5,75 г;
— мединал — 3,75 г;
— натрия хлорид (NaCl) — 85 г.

Указанную навеску веронала растворить в 500 мл горячей дистиллированной воды (около 60 °С), затем внести другие компоненты. Смесь охладить и довести до объема 2000 мл. Для повышения активности комплемента добавить:

СаС12 • 2Н2O — 0,22 г MgС12 • 6Н2O — 1,0 г

При необходимости pH раствора доводить растворами НС1 или NaOH. Буфер хранить в холодильнике. Для приготовления рабочего раствора буфера к 1 объему 5-кратного буфера добавить 4 объема дистиллированной воды.

Веронал-мединаловый буфер 0,2 М pH 8,56 для реакции иммунодиффузии (по Д. В. Белокриницкому, 1987) готовят следующим образом: 5,52 г веронала растворяют в 300 мл дистиллированной воды, нагревают постоянно перемешивая, добавляют 35,04 г мединала. Охлаждают до 20 °С, после чего добавляют дистиллированную воду до 1000 мл.

Веронал-мединаловый буфер 0,12 М pH 8,56 для реакции иммунодиффузии (по Е. В. Чернохвостовой, Г. П. Герман) готовят следующим образом: мединал, 0,1 М 20,6 г, растворяют в 300 мл дистиллированной воды на водяной бане. Охлаждают до 20 °С, после чего добавляют веронал (0,02 М) — 3,7 г, доводят до 1000 мл дистиллированной водой.

а) Реактивы для исследования фагоцитарной активности лейкоцитов:

• Раствор нитро-синего тетразолия для НСТ-теста: 4 мг НСТ (мол. масса 817,6) смешивают с 1 мл фосфатно-солевого буфера—ФСБ (pH 7,2-7,4). Выдерживают в термостате 30-40 мин при 37 °С для лучшего растворения. Фильтруют. Готовят непосредственно перед использованием.

• Раствор гепарина: 1 мл стандартного раствора активностью 5000 Ед разводят в 9 мл изотонического раствора натрия хлорида (1:10). Хранят в холодильнике. Вносят в пробирку 0,2 мл разведенного гепарина и 10 мл венозной крови. Конечная концентрация гепарина 10 Ед/1 мл крови.

• Взвесь латекса для исследования поглотительной способности лейкоцитов: 0,1 мл 10% взвеси латексных частиц размером 0,8-1,4 мкм разводят в 10 мл ФСБ или раствора Хенкса. Получают 0,1% рабочий раствор латексных частиц, который используют в тесте.

• Раствор нитро-синего тетразолия для НСТ-теста: 4 мг НСТ («Sigma», США, мол. масса 817,6) растворяют в 1 мл ФСБ pH 7,2-7,4 или стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Выдерживают в термостате 30-40 мин при 37 °С. Фильтруют. Готовят непосредственно перед итспользованием.

• 1% раствор метилового зеленого: 1 г метилового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют, хранят в холодильнике. Для полной очистки и удаления примесей раствор красителя смешивают с равным объемом хлороформа. После расслоения смеси сливают водную часть. Процедуру повторяют 2-3 раза до получения чистого зеленого цвета красителя. Операцию проводят в вытяжном шкафу.

• Фиколл-верографиновый (урогафиновый) раствор: 20 г фиколла («Pharmacia», Швеция), 50 мл 76% раствора урографина (ФАО «Феррейн», РФ), 280 мл воды дистиллированной. Смешать. Получают градиент плотностью 1,076 г/см2. При добавлении дополнительно 76% урогафина под контролем ареометра получают градиент с плотностью 1,118 г/см2.

б) Бифталатный агар (pH 6,2) для определения лизоцима:

• 20,42 г калия бифталата растворить в 1000 мл дистиллированной воды (0,1 N раствор калия бифталата); заданное значение pH достигают добавлением 2 N раствора натрия гидроксида (NaOH).

• К 100 мл калия бифталата с pH 6,2 добавляют 1 г агар-агара, нагревают до полного растворения агара, доводят до кипения, стерилизуют 15 мин при 115°С в автоклаве.

- Читать далее "Диагностические препараты для диагностики бактериальных инфекций и идентификации возбудителей"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.