Простая (одиночная) радиальная иммунодиффузия по Манчини (G. Mancini, 1965) используется для количественного определения изотипов иммуноглобулинов, компонентов системы комплемента в сыворотке и др. Принцип метода состоит в следующем: на твердую основу (стеклянную или полистироловую пластинку) наносят слой агара с моноспецифической антисывороткой к одному из изотипов иммуноглобулинов (антитело). В этом слое делают лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку пациента (антиген).

Антиген из лунок диффундирует в гель, где встречается с антителами, что сопровождается образованием зоны помутнения в агаре (преципитат) в виде кольца преципитата. Диаметр кольца увеличивается до тех пор, пока весь внесенный антиген не будет связан антителом, внесенным в гель. Площадь этой зоны прямо пропорциональна количеству внесенного в лунки антигена (т. е. количеству иммуноглобулина определенного класса), которое устанавливают по калибровочной кривой.

Для постановки реакции необходимо иметь:
— моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов М, G и А (выпускаются в нашей стране в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалея РАМН, НИИВС им. И. И. Мечникова);
— образцы сыворотки крови от обследуемых лиц;
— стандартную референс-сыворотку, полученную от здоровых доноров (выпускается в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалея РАМН);
— 3% агар Дифко или Нобля («Difco», США) или агарозы в веронал-мединаловом буфере 0,12 М, pH 8,56. (Для приготовления такого геля навеску 3 г агара растворяют в 50 мл дистиллированной воды, нагревая на слабом огне при постоянном перемешивании в течение 40 мин. Затем, продолжая нагревать, добавляют 50 мл 0,2 М веронал-мединалового буфера pH 8,56, перемешивают до полного растворения агара, не доводя до кипения);
— веронал-мединаловый буфер 0,12 М pH 8,56;
— окрашивающую жидкость: амидо-черный — 1 г, уксусная кислота ледяная — 100 мл, вода дистиллированная—до 1000 мл; перемешать, профильтровать;
— отмывающий раствор: уксусная кислота ледяная 70 мл, вода дистиллированная до 1000 мл;
— стекла размером 9х 12 см, П-образную рамку 120x90x8 мм толщиной 1 мм;
— пробойник;
— водяную баню на 50-60 °С;
— влажную камеру.

а) Постановка реакции и учет результатов. Для количественного определения изотипов иммуноглобулинов готовят агаровый гель: 4 мл растопленного и охлажденного до 56 °С 3% агара Дифко смешивают с равным количеством моноспецифической сыворотки против одного из изотипов иммуноглобулина, разведенной веронал-мединаловым буфером 0,12 М pH 8,6 до 1/2 рабочего разведения (см. ниже). Этот гель используют для заливки стеклянной пластины следующим образом: берут 2 стеклянные пластины 9х12 см, одну из них смазывают гидрофобной жидкостью (например, КГЖ-94), другую—тонким слоем агара.

Между этими пластинами устанавливают П-образную рамку 120x90x8 мм, толщиной 1 мм и всю систему скрепляют зажимами. В пространство между пластинами выливают 8 мл приготовленного агарового геля с антиглобулиновой сывороткой. После застывания геля снимают зажимы, рамку и пластину, обработанную гидрофобной жидкостью. В дальнейшей работе используют стеклянную пластину с застывшим гелем (при достаточном опыте можно заливать агаровый гель непосредственно на стеклянную пластину). Если необходимо определить иммуноглобулины трех изотипов (IgM, IgG, IgA), готовят 3 пластины, залитые гелем, как описано выше. На каждой пластине пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм друг от друга (7 рядов по 5 лунок в каждом).

Важным этапом в проведении теста является построение калибровочных кривых. Для этого в лунки второго ряда каждой пластины вносят по 2 мкм стандартной референс-сыворотки—неразведенной и в разведениях 1:2-1:16. Такая сыворотка содержит определенное количество иммуноглобулинов классов М, G и А. Можно приготовить собственный рабочий стандарт из смеси свежих сывороток от здоровых доноров, откалиброванных по референс-сыворотке.

В оставшиеся лунки вносят сыворотки обследуемых лиц в объеме по 2 мкл. Пластины помещают во влажную камеру и инкубируют 24 ч при 4°С. Затем их. на 48 ч погружают в забуференный изотонический раствор натрия хлорида для отмывки от несвязавшихся белков с троекратной сменой буфера.

Измеряют диаметр колец преципитации во втором ряду лунок со стандартной референс-сывороткой и ее разведениями. Строят калибровочные кривые, где на оси ординат откладывают концентрацию иммуноглобулина, а на оси абцисс— диаметр колец. В дальнейшем по этим калибровочным кривым определяют концентрацию иммуноглобулинов изотипов М, G и А в сыворотках обследуемых лиц. Калибровочные кривые строят отдельно для каждой пластины.

Линии преципитации, образовавшиеся в геле, можно окрасить различными методами. Для этого предварительно пластины заливают изотоническим раствором натрия хлорида, меняя раствор несколько раз в течение 3 дней. Затем тщательно несколько раз промывают водой. Агар покрывают несколькими слоями влажной фильтровальной бумаги и высушивают при 37 °С до превращения его в тонкую пленку. Стеклянные пластины с высушенными агаровыми пленками окрашивают. Для окрашивания линий белка используют один из следующих красителей: амидочерный, азокармин, бромфеноловый синий, бромкрезоловый зеленый. Пластинки помещают в краситель на 4 ч.

Затем промывают в двух порциях отмывающего раствора. Высушивают при 37 °С. После такой обработки с пластины можно снять тонкую пленку высушенного геля с результатами реакции и сохранять в качестве протокола опыта.

Для окраски липидов и липопротеинов применяют насыщенный раствор Судана черного в 60% этиловом спирте. Пластины выдерживают в растворе этого красителя 2 ч, отмывают 2 раза 50% этанолом по 15 мин. Затем их помещают в 20% раствор глицерина, содержащий 2% ледяной уксусной кислоты, инкубируют 4 ч при 37 °С. Высушивают после извлечения из раствора при той же температуре и снимают пленки геля с результатами реакции со стеклянной пластины.

б) Определение рабочего разведения моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов М, G и А. Готовят ряд разведений 1:10-1:80 каждой из антисывороток в 0,1 М веронал-мединаловом буфере pH 8,6. В пробирки, содержащие по 1 мл растопленного и охлажденного до 56° С 3% агара, которые помещены на водяную баню, добавляют по 1 мл приготовленных разведений монорецепторной антисыворотки и хорошо перемешивают.

Смесь агара и антисыворотки выливают между стеклянными пластинами, сконструированными, как описано выше. Сначала используют 2 мл антисыворотки в разведении 1:80. После застывания вносят 2 мл в разведении 1:40 и далее добавляют каждое последующее разведение после застывания предыдущего. Таким образом, на одной пластине размещается 4 ряда смеси по 2 мл, содержащей разведения антисыворотки и агар. После застывания последнего ряда и снятия зажимов, рамки и пластины, обработанной гидрофобной жидкостью, освобождают пластину со слоем агара и антисыворотки. В этом слое пробойником делают лунки, в которые вносят разведения стандартной референс-сыворотки в объеме 2 мкл. Через 24 ч инкубации при 4 °С оценивают результаты.

Рабочим разведением антисыворотки считается ее максимальное разведение, при котором образуются четкие кольца преципитации со стандартной референс-сывороткой, интенсивность которых достаточна для их измерения.

в) Методы иммуноэлектрофореза используются для выявления антигенов или антител в том случае, если миграция компонентов иммунного комплекса проходит в электрическом поле. При этом достигается разделение антигенов и антител на компоненты в соответствии с их подвижностью и зарядом. Используют методы простого, ракетного или встречного иммуноэлектрофореза.

Метод простого иммуноэлектрофореза включает 2 этапа:
— электрофоретическое разделение смеси антигенов в геле;
— выявление разделенных антигенов при помощи антител-преципитинов путем свободного диффундирования их навстречу антигенам. В геле, в области эквивалентности, формируются визуально различимые линии преципитата (двойная радиальная иммунодиффузия).

В ракетном иммуноэлектрофорезе движение антигена в электрическом поле происходит в геле, содержащем антитела. В области эквивалентности концентраций антигена и антител формируется преципитат в виде факела ракеты.

Метод встречного иммуноэлектрофореза основан на движении антигена и антитела навстречу друг другу под действием электрического поля. Белковые и полисахаридные антигены заряжены отрицательно и движутся по направлению к аноду. Молекулы иммуноглобулинов движутся к катоду. Формируется видимый преципитат в виде прямой линии, перпендикулярной направлению движения антигена и антител.

- Читать далее "Методика проведения реакции лизиса"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.08.2019