Методика проведения реакции лизиса

Реакция лизиса проявляется растворением (лизисом) микроорганизмов или других клеток в результате взаимодействия с антителом в присутствии комплемента. Антитела, вызывающие лизис клеток, называются лизинами: бактериолизинами (разрушают бактерии), спирохетолизинами (разрушают спирохеты), гемолизинами (разрушают эритроциты) и др. Реакции лизиса используются с целью определения вида возбудителей инфекционного заболевания или обнаружения антител в сыворотке крови пациентов.

Реакцию ставят в пробирке или используют животных. Например, на морских свинках проводят феномен Исаева—Пфейфера с целью идентификации холерного вибриона. В пробирочных тестах используют иммунные сыворотки, инактивированные прогреванием на водяной бане при 37 °С в течение 30 мин, что приводит к разрушению комплемента. В течение реакции лизиса выделяют несколько фаз, которые можно наблюдать под микроскопом:
— потеря подвижности микроорганизмами;
— набухание клеток;
— распад и растворение клеток.

Весь этот процесс занимает 15-20 мин и протекает при температуре 37 °С.

Для постановки реакции бактериолиза необходимо иметь:
— взвесь живых микробов, содержащую 1 млрд микробных тел в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида;
— инактивированную прогреванием иммунную сыворотку, разведенную 1:10 (1 мл сыворотки + 9 мл изотонического раствора натрия хлорида);
— комплемент (смесь свежих сывороток 3-4 морских свинок или растворенный сухой комплемент в ампулах, согласно наставлению);
— изотонический раствор натрия хлорида;
— три пробирки в штативе (опытная и 2 контрольных);
— градуированные пипетки.

Методика проведения реакции лизиса

В опытную пробирку вносят 0,5 мл разведенной 1:10 инактивированной иммунной сыворотки, прибавляют 0,1 мл антигена и 0,1 мл комплемента. Во вторую пробирку вносят эти же компоненты, но без комплемента—контроль на инактивацию комплемента в иммунной сыворотке. В третью пробирку вносят 0,1 мл антигена и 0,1 мл комплемента—контроль комплемента. Затем во все пробирки добавляют изотонический раствор натрия хлорида, доводя количество жидкости до 2 мл.

Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 2 ч. После этого производят количественный высев из всех пробирок в чашки Петри с плотной питательной средой для получения изолированных колоний. Чашки Петри инкубируют в термостате при 37 °С и через 18-24 ч подсчитывают количество выросших колоний.

Бактерии в результате взаимодействия лизинов и комлемента разрушаются, поэтому число выросших колоний при высеве из опытной пробирки будет в десятки и даже сотни раз меньше, чем из контрольных пробирок.

Реакцию бактериолиза можно проводить в опытах на морских свинках. Опытной морской свинке внутрибрюшинно вводят смесь из 1 мл культуры бактерий плотностью 250 млн/мл и 0,2 мл цельной инактивированной иммунной сыворотки, контрольной свинке—смесь из бактерий и инактивированной нормальной сыворотки. Спустя 10, 30 и 60 мин берут перитонеальный экссудат и исследуют его в препарате «раздавленная капля». В положительном случае видны разные стадии бактериолиза: обездвиживание, набухание и растворение бактерий.

В препаратах, приготовленных из экссудата от контрольной свинки (или при отрицательном результате теста), бактерии в ранние сроки не изменены, в поздние — количество их увеличивается.

В том случае, если антигеном являются эритроциты животных различного вида, происходит реакция гемолиза. Это реакция растворения эритроцитов при взаимодействии с антителами-гемолизинами (антиэритроцитарные антитела) в присутствии комплемента. Гемолизины образуются при иммунизации кроликов эритроцитами животного другого вида (например, эритроцитами барана). Сыворотка, полученная от таких кроликов, называется гемолитической сывороткой. Реакция гемолиза проявляется растворением (гемолизом) эритроцитов, при этом нарушается связь гемоглобина со стромой эритроцитов и выход его в раствор. Взвесь эритроцитов в физиологическом растворе превращается в прозрачную ярко-красную жидкость (лаковую кровь).

Реакция гемолиза в виду своей демонстративности получила широкое распространение в лабораторной практике. Ее используют для определения титра гемолитической сыворотки, титра комплемента (см. ниже) и как индикаторную систему в реакции связывания комплемента (РСК).

Определение титра гемолитической сыворотки. Титром гемолитической сыворотки называют максимальное ее разведение, способное в объеме 0,5 мл вызвать полный гемолиз 0,5 мл 5% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, в течение 1 ч при 37 °С. Гемолитическую сыворотку выпускают в ампулах в лиофинизированном виде. На этикетке ампулы указан титр сыворотки и обозначен срок ее годности. Перед использованием такой сыворотки проверяют ее титр.

Для проведения реакции необходимы:
— кроличья гемолитическая сыворотка против эритроцитов барана;
— 5% взвесь эритроцитов барана;
— комплемент;
— изотонический раствор натрия хлорида;
— штативы с пробирками;
— градуированные пипетки.

Методика проведения реакции лизиса

Предварительно готовят разведения гемолитической сыворотки. КОД мл тестируемой сыворотки прибавляют 9,9 мл изотонического раствора натрия хлорида, получая основное разведение 1:100, из которого готовят ряд разведений — от 1:1000 до 1:4500.

Ставят параллельный ряд пробирок, в которые переносят разведенную сыворотку по 0,5 мл, начиная с большего разведения. В пробирки этого ряда вносят по 0,5 мл 5% взвесь эритроцитов барана и по 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10. Затем общий объем жидкости в каждой пробирке доводят изотоническим раствором натрия хлорида до 2,5 мл.

Ставят 3 контроля:
— контроль на инактивацию комплемента (К1);
— контроль комплемента на отсутствие в нормальной сыворотке морских свинок гемолизинов к эритроцитам барана (К2);
— контроль на устойчивость эритроцитов к температуре 37 °С (КЗ).

Результаты реакции гемолиза учитывают через 1 ч инкубации в термостате при 37 °С.

Штатив с пробирками помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 °С.

Методика проведения реакции лизиса

- Читать далее "Методика проведения реакции связывания комплемента (РСК)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.