Наличие фагов бактерий группы кишечных палочек является косвенным показателем возможного присутствия энтеровирусов в исследуемой пробе воды. Коли-фаги вызывают лизис Е. coli, что можно наблюдать по образованию зон лизиса (бляшек) на питательном агаре при 37(±1)°С через 18(±2) ч после посева. В качестве тест-культуры используется фаголизабельный штамм (Е. coli К12 Str®).

Чаще всего зоны лизиса выглядят как круглые изолированные прозрачные зоны (бляшки диаметром от 1 до 5-7 мм) на фоне газона тест-культуры. Границы бляшек могут быть как четко выраженными, так и смазанными. Если концентрация фага высока, то из-за слияния негативных колоний могут наблюдаться: «ажурный газон» Е. coli, рост единичных колоний кишечной палочки на фоне сплошного лизиса или полное отсутствие бактериального роста на чашке Петри.

Определение коли-фагов проводят титрационным или прямым методом. Прямым методом пользуются параллельно с титрационным при исследованиях по эпидемическим показаниям.

Контрольный коли-фаг MS2, штамм ВКПМ-3254 E.coli К12 F+ Str® получают в ГНИИ «Генетика» —Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

а) Подготовка тест-культуры. По стандарту мутности готовят суспензию суточной культуры Е. coli К12 Str® с концентрацией 10⁹ клеток в 1 мл. Можно также использовать 4-часовую бульонную культуру, полученную путем подращивания при 37(±1)°С (в 2 мл такой культуры должно содержаться 10⁹ клеток).

б) Титрационный метод. Выявление зон лизиса газона Е. coli на питательном агаре осуществляется после предварительного накопления коли-фагов в среде обогащения на культуре Е. coli.

1. Качественный анализ. В исследуемую пробу воды объемом 100 мл вносят 10 мл концентрированного (х10) питательного бульона и 1 мл подготовленного смыва тест-культуры (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры). Параллельно, для контроля тест-культуры на лизогенность, 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) вносят в чашку Петри и заливают питательным агаром. Исследуемую воду и чашку с контролем инкубируют при 37(±1) °С в течение 18(±2)ч.

После инкубации из исследуемой пробы отбирают в стерильную пробирку 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа (для освобождения от бактерий). Пробирку, закрытую стерильной резиновой (силиконовой) пробкой, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 15 мин до полного осаждения хлороформа.

В 100 мл предварительно расплавленного и остуженного до 45-49 °С питательного агара добавляют 1 мл свежеприготовленного смыва тест-организма (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры). Затем приготовленную смесь хорошо перемешивают.

В стерильную чашку Петри вносят 1 мл пробы, обработанной хлороформом, заливают 12-15 мл питательного агара, засеянного тест-культурой Е. coli, и осторожно перемешивают содержимое. Дополнительно (для контроля культуры тест-организма) этой же средой с бактериями заливают пустую стерильную чашку Петри. После застывания питательной среды чашки переворачивают вверх дном и инкубируют при 37(±1)°С в течение 18(+2) ч.

Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, появлении одной или нескольких бляшек просветления на чашке с исследуемой пробой воды. При этом зоны лизиса на контрольной чашке должны отсутствовать (в противном случае результат считается недействительным). Результат анализа—коли-фаги обнаружены (не обнаружены) в 100 мл воды.

2. Количественный анализ. 100 мл исследуемой воды делят на 6 объемов (1 флакон — 50 мл и 5 пробирок по 10 мл). В пробу 50 мл вносят 5 мл концентрированного (х10) питательного бульона и 0,5 мл смыва тест-организма (или 1 мл 4-часовой бульонной культуры). В каждые 10 мл пробы добавляют по 1 мл концентрированного (х10) питательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры). Если исследуют воду объемом 1000 мл, вносят 100 мл 10-кратного питательного бульона и 10 мл смыва Е. coli. Посевы инкубируют при 37(±1) °С в течение 18(±2) ч.

После инкубации из флаконов с 50 мл воды (или 1000 мл при исследовании соответствующего объема воды) пробы отбирают в пробирку 10 мл. Затем в эту пробирку и в 5 остальных пробирок (изначально содержавших по 10 мл пробы) вносят по 1 мл хлороформа. Пробирки, закрытые стерильными резиновыми (силиконовыми) пробками, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 15 мин до полного осаждения хлороформа.

В 100 мл предварительно расплавленного и остуженного до 45-49 °С питательного агара добавляют 1 мл свежеприготовленного смыва тест-организма (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) и перемешивают полученную смесь. Засеянную таким образом питательную среду разливают по стерильным чашкам Петри (одна чашка для контроля тест-культуры на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды).

После застывания среды дно каждой чашки, предназначенной для посева проб, делят на 6 секторов, маркируя их в соответствии с исследуемыми объемами воды. На каждый сектор из соответствующей пробирки наносят пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по одной капле исследуемой воды. После подсыхания капель чашки (включая контрольную) переворачивают и инкубируют при 37(±1)°С в течение 18(±2) ч.

Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии зоны лизиса (округлое пятно, отдельные бляшки или лизис по ходу штриха) хотя бы на одном секторе при полном отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

Количественную оценку проводят по таблице расчета НВЧ.

в) Метод прямого определения. Сущность метода заключается в прямом посеве нормируемого объема воды и последующем учете зон лизиса (бляшек) на газоне Е. coli в чашках Петри с питательным агаром.

В 100 мл предварительно расплавленного и остуженного до 45-49 °С питательного агара двойной концентрации добавляют 1 мл свежеприготовленного смыва Е. coli (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры). Смесь хорошо перемешивают.

Исследуемую пробу воды (100 мл) делят на 5 частей, разливая по 20 мл в большие стерильные пробирки, которые нагревают до 35-44 °С и немедленно (не более чем через 5 мин после достижения нужной температуры) разливают в стерильные чашки Петри (каждую пробу в отдельную чашку). Затем в каждую чашку заливают по 20 мл засеянного тест-культурой питательного агара и аккуратно перемешивают. Для контроля на лизогенность Е. coli те же манипуляции производят с 20 мл стерильной водопроводной воды.

После застывания питательной среды чашки переворачивают вверх дном и инкубируют при 37(±1)°С в течение 18±2 ч. Предварительный учет результатов можно проводить через 5-6 ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии коли-фагов в воде.

После инкубации подсчитывают и суммируют все бляшки, образовавшиеся на пяти чашках Петри (при отсутствии таковых в контроле). Таким образом, получают количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 100 мл воды.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5-7 мм в диаметре) с четко выраженными либо стертыми границами.

При высоких концентрациях фага наблюдается разная картина лизиса. Слияние негативных колоний дает «ажурный» газон Е. coli, рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса либо полное отсутствие роста на чашке. При прямом посеве возможен лизис, маскируемый негомогенно застывшим агаром, а также закрытый сопутствующей микрофлорой. Капли конденсата и негомогенно застывший при прямом посеве агар могут приводить к образованию артефактов на газоне Е. coli, визуально напоминающих лизис.

Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «Обнаружено в 100 мл воды».

При получении отрицательного результата при исследовании прямым методом окончательный ответ выдается по результатам титрационного метода.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

г) Методика подтверждения фаговой природы лизиса. В сомнительных случаях при исследовании как титрационным, так и прямым методом необходимо провести контрольный посев для подтверждения фаговой природы лизиса. С этой целью бактериологической петлей извлекают участок агара, подозрительный на наличие коли-фагов, помещают его в 5 мл питательного бульона, куда добавляют каплю тест-культуры Е. coli и инкубируют при 37 °С в течение 16-18 ч.

Полученную культуру обрабатывают хлороформом и исследуют на наличие фага. Высев осуществляют петлей или пипеткой на сектора питательного агара аналогично способу, описанному в отдельной статье на сайте. Лизис на любом из секторов расценивается как подтверждение наличия фага.

- Читать далее "Определение синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) в воде"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 24.09.2019