Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при 37(±1)°С на среде Эндо, дифференцировании выросших колоний и подсчете ОКБ и ТКБ в 1 л воды.

Для фильтрования воды используют мембранные фильтры (ацетатцеллюлозные, нитратцеллюлозные и др.) с диаметром пор не более 0,45 мкм. Диаметр диска фильтра должен составлять 35 или 47 мм.

Если используемые фильтры выпускаются промышленностью нестерильными, то их стерилизуют, руководствуясь специальной инструкцией, предложенной изготовителем. Если инструкции нет, то фильтры стерилизуют методом кипячения. Для стерилизации кипячением фильтры помещают в стеклянный стакан с подогретой до 80 °С дистиллированной водой и ставят на слабый огонь до закипания. Кипячение фильтров производят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают. После последнего кипячения воду не сливают и фильтры оставляют в ней до употребления.

Объем воды водоемов для посева выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения. Посевной объем рассчитывают, чтобы не менее чем на двух фильтрах выросли изолированные колонии.

Перед работой фильтровальный аппарат (Зейтца, Гольдмана-Семенова и др.) протирают смоченным спиртом тампоном и стерилизуют фламбированием. После охлаждения на столик фильтровального аппарата помещают стерильный фильтр и закрепляют его верхней частью прибора. Фильтровальный аппарат присоединяют к вакуум-насосу (разрежение 0,5-1,0 атм). Для каждого разведения используют отдельный фильтр. Если в исследуемой воде содержится большое количество взвешенных веществ, то ее сначала фильтруют через фильтр с порами большого диаметра, помещая его поверх основного фильтра.

Начинают исследования с больших разведений. Перед фильтрованием каждой новой пробы воды аппарат обеззараживают. При посевах объемов 1 мл и меньше их разводят в 10 мл стерильной водопроводной воды, а затем фильтруют. После окончания фильтрации фильтры (включая те, что использовались для удаления взвешенных частиц) укладывают на поверхность среды Эндо в чашках Петри фильтрующей поверхностью вверх, следя при этом за тем, чтобы под фильтрами не было пузырьков воздуха. На одну чашку можно помещать 3-4 фильтра, но так, чтобы они не соприкасались.

Чашки с фильтрами переворачивают вверх дном и выдерживают 24(±2) ч при 37(±1)°С. Если микробный рост отсутствует или обнаружены колонии, не характерные для ОКБ (пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые), то исследование можно закончить с выдачей отрицательного результата (ОКБ и ТКБ в исследуемом объеме воды отсутствуют). В случае обнаружения подозрительных колоний для подсчета выбирают фильтры, на которых выросло не более 30 таких колоний (это фильтры диаметром 35 мм) или не более 50 (фильтры диаметром 47 мм). Учету подлежат все красные или темно-красные колонии с металлическим блеском или без него либо другие подобного типа с отпечатком на обратной стороне фильтра. Подсчитывают число колоний каждого типа и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ.

Каждую из выбранных колоний исследуют на наличие оксидазы. Готовят мазки и окрашивают их по Граму. Для установления грампринадлежнос-ти допустимо также использование теста Грегерсена. Для подтверждения способности к сбраживанию лактозы до кислоты и газа производят посев материала из каждой выявленной оксидазоотрицательной грамотрицательной колонии параллельно в две пробирки с лактозной средой. Одна из пробирок должна быть предварительно прогрета до 44 °С. Посев в прогретую среду инкубируют при 44(+0,5)°С в течение 24 ч (для подтверждения наличия ТКБ). Второй посев выдерживают при 37(±1) °С в течение 48 ч (для подтверждения наличия ОКБ).

Обнаружение кислоты и газа при росте на лактозной среде позволяет дать положительный ответ. Если кислота и газ отсутствуют или выявлена только кислота, то посевы оставляют на 24 ч для окончательного ответа при учете ТКБ и на 48 ч — при учете ОКБ.

При анализе питьевой воды и воды водоемов число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и затем вычисляют число КОЕ на 100 мл воды.

- Читать далее "Определение числа спор сульфитредуцирующих клостридий в воде"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 24.09.2019