Определение синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) в воде

Pseudomonas aeruginosa относится к потенциально патогенным микроорганизмам. Это подвижные прямые или слегка изогнутые палочки с закругленными концами (0,5-0,7 х 1-3 мкм). В мазках обычно расположены одиночно, парами или короткими цепочками. Грамотрицательны, строгие аэробы, оксидазоположительны. Растут при температуре от 6 до 45 °С, оптимальная температура для роста 37 °С, но хорошо растут и при температуре 42 °С. Оптимум pH 7,2-7,5.

Р. aeruginosa синтезирует триметиламин, придающий культурам запах жасмина, винограда или карамели. Характерное свойство — появление уже к концу первых суток сине-зеленого окрашивания культуры с последующим проникновением пигмента (пиоцианина) в питательную среду. Восстанавливает нитраты до нитритов и далее до молекулярного азота.

а) Метод мембранной фильтрации. Сущность метода и техника проведения фильтрования пробы описана в отдельной статье на сайте. Добавим, что при анализе минеральных вод фильтр после окончания фильтрации исследуемой пробы воды промывают в 2-3 см3 стерильной водопроводной воды. Если фильтруют воду с общей минерализацией 4 г/дм3 и выше, то мембранный фильтр промывают дважды в 5 см3 стерильной водопроводной воды.

После окончания фильтрования фильтр переносят на поверхность среды Эндо в чашке Петри, фильтрующей стороной вверх. Посевы инкубируют при 37(±1)°С в течение 18-24 ч.

На среде Эндо синегнойная палочка образует плоские неправильной формы колонии, иногда склонные к слиянию, с волнистыми краями; складчатые с неровной поверхностью (маргаритки); слизистые или мукоидные колонии; карликовые или точечные колонии. Цвет колоний на среде Эндо от бледно-сиреневого до темно-сиреневого. Выбирают 2-3 характерные колонии. Микроскопируют, окрашивают по Граму. Материал из грамотрицательных колоний отсевают уколом на среду Хью-Лейфсона (О/Ф) и штрихом на поверхность среды Кинг А. Все посевы культивируют при 37(+1) °С в течение 24-48 ч.

На среде Хью-Лейфсона Р. aeruginosa окисляет глюкозу, но не ферментирует ее, при этом первоначальный зеленый цвет среды изменяется в верхней части столбика на желтый, а нижняя часть остается зеленой [О/Ф (+/-)]. На среде Кинг А колонии Р. aeruginosa плоские с неровными краями, характерно наличие пигмента, который диффундирует в толщу среды.

Типичные колонии, выросшие на среде Кинг А, исследуют в оксидазном тесте (о проведении теста см. раздел, посвященный описанию определения колиформных бактерий титрационным методом). Если обнаруживаются оксидазоположительные бактерии, окисляющие глюкозу на среде О/Ф и образующие пигмент на среде Кинг А, их относят к Р. aeruginosa. Апигментные колонии параллельно исследуют на подвижность и наличие нитратредуктазы.

Для определения подвижности производят посев уколом в толщу питательного агара (содержит 2 % агар-агара), сверху заливают 0,5 % агаром и оставляют засеянные таким образом чашки Петри, не переворачивая, при комнатной температуре на 24 ч. Веерообразный рост бактерий вокруг укола на поверхности питательной среды свидетельствует об их подвижности.

Для выявления нитратредуктазы производят посев уколом на нитратную среду. Посевы культивируют при 42(±0,5)°С в течение 24 ч. В результате развития Р. aeruginosa происходит помутнение среды и выделение свободного азота, которое можно заметить по появлению пены на поверхности среды и иногда по наличию пузырьков газа в толще среды.

б) Метод определения Pseudomonas aeruginosa на средах Бонде и «Блеск». Исследуют пробу воды объемом 1000 мл, разделенную в две емкости по 500 мл. В каждую емкость добавляют по 50 мл среды Бонде, тщательно перемешивают и инкубируют при температуре 37(+1)°С в течение 24-48 ч.

Через 24 ч просматривают посевы. При наличии роста Pseudomonas aeruginosa происходит помутнение среды Бонде и на поверхности появляется тонкая прозрачная пленка, часто поднимающаяся по стенке емкости. В журнале отмечают помутнение среды и образование пленки.

Для подтверждения наличия Pseudomonas aeruginosa делают посев на среду «Блеск». Емкость перед посевом не взбалтывать. Петлей забирают пленку и делают посев штрихом для получения изолированных колоний и в виде бляшки — по 3-4 из каждой емкости. Посев в виде бляшки производят следующим образом: делают укол петлей до дна чашки и затем растирают небольшую площадку вокруг укола по поверхности среды. Допустимо делать посев нескольких проб на секторах одной чашки.

Посевы со средой «Блеск» инкубируют при температуре 37(±1)°С в течение 24 ч. Емкости со средой Бонде оставляют в термостате еще на 24 ч для окончательного учета.

Через 24 ч отмечают характер роста на среде «Блеск». При наличии в пробе Р. aeruginosa на среде «Блеск» вырастают темно-красные колонии с золотистым блеском или золотистыми вкраплениями на бляшках. Появление блеска можно наблюдать уже через 20-22 ч инкубации при температуре 37 °С, но максимального развития реакция достигает через 42-44 ч.

Если на среде «Блеск» не отмечено роста или выросли колонии темно-красного, темно-вишневого цвета, но без характерного блеска, то из емкостей, где отмечено помутнение или помутнение с пленкой, высев следует повторить через 48 ч.

При отсутствии роста в среде Бонде через 24 ч пробу инкубируют до 48 ч и в случае помутнения и образования пленки подтверждают Р. aeruginosa на среде «Блеск», как указано выше.

Подтвердить наличие Р. aeruginosa также можно путем посева подозрительной изолированной колонии на косяк с питательным агаром, на котором через 24 ч инкубации при температуре 37 °С в случае положительной реакции появляется синий, сине-зеленый, зелено-желтый пигмент. Пигментация может усиливаться при последующем выдерживании косяка на свету при комнатной температуре.

Отрицательный ответ выдают: при отсутствии признаков роста в посевах пробы в среду Бонде; при отсутствии роста на среде «Блеск»; при росте на среде «Блеск» не характерных для Р. aeruginosa колоний без блеска. Вывод: Р. aeruginosa не обнаружена в 1000 мл воды.

Положительный ответ выдают: при росте на среде «Блеск» темно-красных колоний с золотистым блеском; при образовании характерного пигмента на питательном агаре. При четкой реакции на среде Бонде (муть и пленка) и среде «Блеск» наличие пигмента определять не обязательно. Результаты вносят в протокол анализа: Р. aeruginosa обнаружена в 1000 мл воды.

- Вернуться в оглавление раздела "Медицинская микробиология"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 24.09.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.