а) Количественное разведение в жидкой питательной среде. Применяют гиогликолевую среду, сердечно-мозговой бульон с 0,5% глюкозы или среду АС. Готовят разведения исходного объема материала в 10, 100, 1000 и т. д. раз, а затем выполняют посев на отдельные чашки Петри в количестве 0,1 мл и равномерно распределяют стеклянным шпателем или тампоном по всей поверхности агаровой среды (посев «сплошной газон»).

б) Количественное распределение на плотной питательной среде в чашке Петри по J. Gold (1965) в модификации В. Г. Мельникова и В. Н. Царева (1992).

Последняя методика предполагает предварительную обработку материала, содержащего биопленку, с помощью ультразвука (5 мин., 60 кГц). Данная модификация позволяет лучше разделить и распределить микробные клетки, находящиеся в виде конгломератов в составе биопленки, особенно, зубной бляшки.

Для достижения этой цели чашку Петри с 5 %-ым кровяным гемин-агаром условно делят на 3 сектора. Посев в 1-й сектор осуществляют одной поверхностью тампона, тщательно растирая материал по поверхности агаровой среды от края к середине чашки Петри и обратно. Затем стерильной стандартной бактериологической петлей выполняют 3 штриха, на основе которых формируют сектор 2. Далее материал тщательно распределяют по поверхности агаровой среды с помощью той же петли в направлении, перпендикулярном линиям посева от края ближайшего к предыдущему сектору в направлении края чашки Петри и обратно. Затем петлю прожигают и выполняют из сектора 2 еще три штриха, на основе которых аналогично формируют сектор 3.

При оценке результатов количественного исследования используют формулу:

N = 2 х n х k,

где n — число колоний микроорганизмов в последнем секторе, на котором отмечен рост; k — множитель, равный 10²-10⁴-10⁶ КОЕ соответственно для секторов 1, 2 и 3.

Дальнейшее культивирование микроорганизмов осуществляют в анаэробных условиях до 7 суток при температуре 37°С. Для создания анаэробиоза используют микроанаэростаты или анаэробные камеры при большом потоке исследований, в которых атмосферный воздух с помощью вакуум-насоса замещается газовой смесью, состоящей из 80% азота, 10% углекислого газа и 10% водорода. Допустимым в условиях практических лабораторий является применение однокомпонентных газовых смесей, например из углекислого газа или инертных газов (аргона, неона и др.).

Для ликвидации остаточного кислорода применяют палладиевые катализаторы и газ-пакеты с химическими поглотителями (пирогаллол, тиосульфат). Следует подчеркнуть, что качественная «прокачка» анаэростата бескислородной газовой смесью с помощью вакуум-насоса 2-3 раза надежно защищает посевы микробных культур от избытка кислорода.

В практической работе (при отсутствии вакуум-насосов и баллонов с газовыми смесями) допустимо применение микроанаэростатов с газ-пакетами, содержащими пирогаллол и другие химические поглотители кислорода. В этих случаях особенно важно проводить индикацию анаэробиоза, для чего обычно применяют индикатор резазурин.

Для получения чистых культур облигатно-анаэробных и микроаэрофильных бактерий в анаэробных условиях используют 5%-й кровяной гемин-агар, приготовленный на основе сердечно-мозгового бульона. В качестве стимуляторов роста анаэробных микробов к кровяному агару добавляют гемин (5 мг/л) или гемоглобин, а также производное витамина К - менадион (0,1 мг/л).

- Читать далее "Этапы выделения и идентификации предполагаемых возбудителей анаэробной (неклостридиальной) инфекции"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 24.4.2020