Этапы выделения и идентификации предполагаемых возбудителей анаэробной (неклостридиальной) инфекции

Классическое бактериологическое исследование с применением техники анаэробного культивирования включает следующие этапы.

а) 1-й этап. Получение изолированных колоний. В 1-й день выполняют посев, предпочтительно, количественный, но описанной выше методике. При использовании транспортных сред это позволит установить количественное соотношение микробов разных видов и исключить гипердиагностку, например, стафилококковой инфекции. Посевы инкубируют в анаэростате с бескислородной газовой смесью при 37°С от 2-х суток (для быстрорастущих кокков, фузобактерий, клостридий) до 7 суток (для медленнорастущих актиномицетов и порфиромонад).

На 2-й день исследования (48 часов и более) в аэробных условиях проводят макроскопическое исследование свойств колоний. Из типичных колоний выполняют мазки для окраски по Граму и прижизненной микроскопии в темном поле для определения подвижности. Исследование должно проводиться в кратчайшие сроки, чтобы избежать гибели облигатно-анаэробных бактерий.

При выявлении возбудителей анаэробной инфекции особенно важно обращать внимание на такие параметры как:
• выявление морфологических типов колоний («глазунья», «моляры», «бурые кляксы», «радужные конусы» и т.п.);
• наличие черного пигмента;
• наличие бета или альфа-гемолиза;
• наличие «бактероидного» запаха;
• тест на аэротолерантность.

Некоторые виды Porphyromonas и Prevotella вырабатывают порфириноподобные пигменты и образуют коричнево-черные колонии, соответственно плотные R-формы/гладкие S-формы.

Колонии Actinomyces могут быть белыми, красными, розовыми, оранжево-коричневыми. Для A. israelii характерно формирование колоний в виде «моляров» (коренных зубов) белого цвета или цвета слоновой кости.

Бактероиды В. urealytica, В. gracilis, а также Wolinella и Е. corrodens вызывают эрозию агаровой среды, эффект вдавливания.

Представители Fusobacterium, в частности F. nucleatum, образуют опалесцирующие «мраморные» колонии с зеленой флюоресценцией (приподнятые, чаще конической формы) или дают рост в виде крошек хлеба, битого стекла. F. mortiferum, F. varium имеют типичную морфологию «глазуньи», что требует дифференциации с некоторыми видами клостридий.

Для быстрой предварительной идентификации при первичном посеве материала используют ряд селективных и дифференциально-диагностических питательных сред.

Желчно-эскулиповый агар, позволяет через 24 часа идентифицировать в первичном посеве В. fragilis — наблюдается рост колоний серого цвета (устойчивы к желчи) с изменением цвета среды в виде коричневого ореола (гидролиз эскулина). Близкородственный вид В. vulgatus не дает ореола, так как не вызывает гидролиза эскулина.

Канамицин-ванкомицин-агар с гемолизированной кровью (см. раздел 5.10) позволяет в течение 48 часов дифференцировать Prevotella и Poiphyromonas, так как последние ингибируются ванкомицином. Следует учитывать, что у некоторых штаммов Prevotella пигментация колоний развивается позже, вплоть до 2-3-х недель. С колониями, выросшими на данной среде проводят тест на флюоресценцию в ультрафиолетовом свете при длине волны 366 нм (от желтого до ярко-красного у разных видов превотелл).

Аналогичную флюоресценцию дают представители рода Poiphyromonas (но не Р. gingivalis), которые растут на 5% кровяном гемин-агаре без селективных добавок.

Фенил-алкоголь-агар — коммерческая селективная среда как для грамположительных, так и для грамогрицательных анаэробов, позволяющая ингибировать рост энтеробактерий, прежде всего, протея в первичном посеве (пропись CDC, США).

Желточный агар позволяет выявить лецитиназную, липазную и протеолитическую активность изолятов в первичном посеве. Эти признаки более типичны почти для всех представителей рода Clostridium, но также могут быть весьма полезными для идентификации тех неклостридиальных анаэробов, которые их имеют. F. nucleatum, F. necrophorum, Р. intermedia, Р. loeschii, продуцирующие липазу, дают вокруг колоний зоны поверхностной опалесценции типа «бензин на воде», или «перламутр».

В отличие от этого лецититиназная активность проявляется также и в глубине среды. Протеазная активность анаэробных культур определяется в виде достаточно узких зон просветления, которые четко видны в проходящем свете.

Тест на аэротолерантность обычно выполняют в виде змеевидных секторальных посевов на 2 чашки с 5%-ым кровяным гемин-агаром, одну из которых помещают в анаэростат, а вторую — оставляют в аэробных условиях. Для дифференциации капнофилов и аэротолерантных актиномицетов и клостридий можно также использовать 3 чашки. В этом случае берут еще одну чашку с «шоколадным» агаром, которую помещают в атмосферу углекислого газа.

Тест на каталазу. Результаты исследования следует дополнить тестом с 5 %-ым раствором перекиси водорода для определения каталазной активности. Следует учитывать, что культуры для воздействия перекисью надо брать неметаллическим предметом и, желательно, с агара, который не содержит эритроцитов. При появлении пузырьков газообразования в капле перекиси делают заключение о наличии каталазной активности у исследуемого штамма.

Из типичных колоний выполняют мазки для окраски по Граму и прижизненной микроскопии в темном поле для определения подвижности.

б) 2-й этап. Получение чистой культуры анаэробных бактерий. На 2-й день исследования, после завершения изучения характера колоний и предварительных (ориентировочных) идентификационных тестов, выполняют посев на скошенный сердечно-мозговой агар или бульон, полужидкую среду АС. Посевы сразу помещают в анаэростат.

На 3-й день (48 часов и более) учитывают результаты роста. Иногда для выращивания культур представителей медленнорастущих видов требуется 5-10 суток.

в) 3-й этап. Идентификация выделенных культур. Классическое анаэробное исследование предполагает идентификацию по биохимическим свойствам.

Идентификация возбудителей анаэробной инфекции представляет собой трудоемкий и методически сложный процесс. В настоящее время она проводится на основании учета следующих идентификационных параметров:
• морфологических и тинкториальных признаков микробов;
• культуральных свойств (характер колоний, пигментообразование, «бактероидный» запах, рост на селективных средах);
• биохимических свойств;
• чувствительности к таксономически важным антибиотикам (гентамицин, канамицин, левомицетин, ванкомицин, эритромицин, метронидазол);
• данных хемотаксономии (хроматографический анализ и лазерно-флюоресцентные исследования);
• антигенной структуры (иммуноферментный анализ и традиционные серологические реакции с сыворотками, которые получают путем иммунизации животных, при необходимости);
• генодиагностики — ДНК-ДНК-гибридизация, полимеразная ценная реакция, а также определение 16S рибосомальной РНК.

При проведении практической лабораторной работы целесообразно выделять различные «линии» идентификации для наиболее близких по своим признакам родов и видов: неклостридиальные бактерии «бактероидной линии», анаэробные кокки, «актиномицетной линии» и другие.

Для ускорения и стандартизации процесса идентификации обычно применяют тест-системы «API Ап» (Франция), «Vitek» (США), «Lachema» (Чехия) и т. н..

Этапы выделения и идентификации предполагаемых возбудителей анаэробной (неклостридиальной) инфекции
Этапы выделения и идентификации предполагаемых возбудителей анаэробной (неклостридиальной) инфекции
Этапы выделения и идентификации предполагаемых возбудителей анаэробной (неклостридиальной) инфекции

- Читать далее "Чувствительность к антибиотикам анаэробных бактерий и ее определение"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 24.4.2020

Оглавление темы "Возбудители анаэробной (неклостридиальной) инфекции.":
  1. Род бактерий Fusobacterium (сем. Fusobacteriaceae)
  2. Род бактерий Leptotrichia (сем. Fusobacteriaceae)
  3. Род бактерий Eikenella (Eikenella corrodens)
  4. Извитые формы грамотрицательных анаэробных жгутиковых бактерий (сем. Acidaminococcaceae, Campylobacteriaceae, Helycobacteriaceae, Lachnospiriceaea, Succinivibrionaceae, Desulfovibrionaceae)
  5. Извитые формы грамотрицательных анаэробных спирохет (сем. Spirochaetaceae)
  6. Патогенез и клиника анаэробной (неклостридиальной) инфекции
  7. Взятие материала для диагностики анаэробной (неклостридиальной) инфекции
  8. Методика количественного исследования анаэробной (неклостридиальной) инфекции
  9. Этапы выделения и идентификации предполагаемых возбудителей анаэробной (неклостридиальной) инфекции
  10. Чувствительность к антибиотикам анаэробных бактерий и ее определение
  11. Заключение об этиологической значимости выделенных штаммов анаэробных бактерий

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.