1. Первый день исследования. Подготовленный материал для исследования засевают на чашки Петри с питательным агаром. Используют мясопептонный агар, агар Хоттингера (pH 7,2-7,5) и селективную дифференциально-диагностическую среду ДДС. Для засева одной пробы желательно использовать 5-10 чашек. Поверхность агара перед посевом должна быть совершенно сухой. Посев необходимо производить при помощи шпателя, предварительно нанося на поверхность агара 1 -2 капли исследуемого материала. Если материал значительно загрязнен посторонней микрофлорой (почва, корма, смывы с поверхностей и пр.) делают посевы методом истощения, распределяя материал шпателем по поверхности агара с переносом на 2-3 чашки.

При исследовании материала, мало загрязненного посторонней микрофлорой (кровь, пунктаты из карбункула, органы биопробных животных), посев можно проводить петлей без истощения, используя при этом МПА, агар Хоттингера, кровяной агар и мясопептонный бульон (МНБ). Посевы помещают в термостат при 37“С на 18-20 ч.

2. Второй день исследования. Посевы с выросшими колониями просматривают не только визуально, но и под малым увеличением микроскопа. На чашках, кроме возбудителя сибирской язвы, наблюдается рост и других спорообразующих сапрофитов, морфологически трудно отличимых от В. anthracis. Для В. anthracis характерно образование шероховатых матовых колоний, край которых напоминает «локоны волос» или «львиную гриву». Колонии В. anthracis трудно снимаются петлей с поверхности агара, в то время как колонии близкородственных сапрофитов снимаются легко. Для идентификации с питательного агара отбирают не менее 10 шероховатых колоний, а при отсутствии такого количества — все шероховатые колонии. Посевы на селективной дифференциально-диагностической среде перед просмотром обрабатывают парами аммиака.

Процедура обработки парами аммиака заключается в следующем. В отдельную крышку от чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают на нее 1,0-2,0 мл аммиака водного (29% концентрированного). Затем чашку с посевами без крышки помещают на несколько секунд (пока не порозовеют колонии сапрофитов) в крышку с аммиаком. Таким образом обрабатывают все посевы. В силу того, что сибиреязвенная бацилла не образует фосфатазу, ее колонии не изменяют своего цвета. Колонии спорообразующих сапрофитов, в том числе и В. cereus, под действием паров аммиака приобретают розовый или красный цвет. С дифференциально-диагностической среды для идентификации отбирают визуально и при помощи микроскопа при малом увеличении (х 8) все колонии, не изменившие своего цвета после обработки парами аммиака.

Из всех отобранных колоний делают мазки на два или более предметных стекла. Мазки фиксируют и окрашивают двумя способами — по Ребигеру (или по Граму) и сибиреязвенной люминесцентной соматической сывороткой. При просмотре мазков учитывают характерную для возбудителя сибирской язвы морфологию (длинные нити, концы палочек обрублены), при окраске люминесцирующими сыворотками — специфическое свечение на 4+ или 3+. Для дальнейшей идентификации отбирают только те колонии, которые состоят из характерных для В. anthracis палочек.

По возможности из колоний, если они расположены изолированно и не соприкасаются с колониями посторонних микробов, делают посевы: на дифференциальнодиагностическую среду, на кровяной агар, на МПБ, на агар с желтком и на скошенный агар. Посев на чашки с питательной средой производят секторами (6-8 колоний на одну чашку).

3. Третий день исследования. Учитывают посевы, проведенные ранее, а также продолжают делать высевы на питательные среды для проведения тестирования микроорганизма — возбудителя сибирской язвы и его дальнейшей идентификации (пробы с фагом, теста «жемчужное ожерелье», теста на лецитиназу, теста на фосфатазу, определения роста в бульоне, подвижности, теста на гемолиз, образование капсулы in vitro). Устанавливают чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

Определение чувствительности сибиреязвенного микроба, выделенного из материала от больных, к антибиотикам. Чувствительность возбудителя сибирской язвы к антибиотикам устанавливают методом диффузии в агар с использованием коммерческих дисков, пропитанных антибиотиками. Обязательными антибиотиками, к которым необходимо определить чувствительность при сибирской язве, являются бензилпенициллин, тетрациклин, доксициклин и рифампицин. Расплавленную питательную среду (МПА или агар Хоттингера, pH 7,2-7,5) разливают по 20 мл в чашки Петри, расположенные на ровной поверхности. Для определения чувствительности используют суточные агаровые культуры. Из выросших колоний готовят взвесь микроорганизмов на физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности РИСК им. Л.А. Тарасевича на 10 ед. (100 млн/мл соответственно для сибиреязвенного микроба). Эту взвесь в объеме 0,3 мл наносят на поверхность питательной среды и равномерно распределяют шпателем.

Чашки выдерживают 30 мин при комнатной температуре для впитывания жидкости. Затем пинцетом на поверхность засеянной питательной среды накладывают диски на одинаковом расстоянии один от другого, отступив от стенки чашки приблизительно на 2 см (не более 6 дисков). Вновь выдерживают 30 мин при комнатной температуре, а затем, перевернув их вверх дном, инкубируют при 37°С в течение 18-20 ч.

4. Четвертый день. Проводят учет микроскопических, бактериологических и биологических методов исследования.

Идентификация выделенной культуры. Идентификацию выделенной культуры проводят по совокупности следующих признаков.

Характерная морфология возбудителя сибирской язвы в мазках, приготовленных из исходного материала, мазках-отпечатках из органов биопробных животных. Учитываются морфологические особенности различных форм В. anthracis: спор, вегетативных палочек и капсульных форм. Во всех случаях при приготовлении мазков обращают внимание на их фиксацию в спирте с добавлением 3% перекиси водорода и окраску соответствующих форм возбудителя. Универсальной краской является раствор Реби-гера, при окраске которым четко видны споры, розовая капсула и синие палочки. 11ри окраске мазков сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками можно увидеть не только морфологические особенности микроба, но и определить специфичность, что существенным образом ускоряет проведение лабораторного анализа.

Характерная морфология выросших на питательном агаре колоний. При использовании МПА, агара Хоттингера ил и дифференциально-диагностической среды колонии сибиреязвенной бациллы отличаются от колоний спорообразующих сапрофитов меньшими размерами, большей шероховатостью и более выраженными «локонами» по периферии. Если масса микробов трудно отбирается бактериологической петлей, это свидетельствует в пользу возбудителя сибирской язвы. При использовании дифференциально-диагностической среды учитываются одновременно два важных диагностических признака — характер выросших колоний и тест на щелочную фосфатазу.

Характер роста на МПБ. Некоторые представители спорообразующих сапрофитов могут расти на бульоне аналогично В. anthracis. Однако при встряхивании пробирки бульон сразу становится мутным, в то время как В. anthracis дает комочек, трудно разбивающийся при встряхивании, и бульон остается прозрачным.

Тест с сибиреязвенным бактериофагом. Возбудитель сибирской язвы лизируется сибиреязвенными фагами (гамма, К и др.). Пробу с фагом ставят следующим образом. Свежеприготовленные чашки с агаром Хоттингера или МПА перед постановкой пробы подсушивают в термостате. Расчерчивают дно чашки снаружи на квадраты со стороной 2 см. Бактериологической петлей или пипеткой на каждый квадрат наносят каплю 5-6-часовой бульонной культуры В. anthracis. Чашку с приоткрытой крышкой подсушивают 30 мин в термостате, а затем в центр подсохшей капли наносят петлей каплю цельного сибиреязвенного бактериофага. Результаты учитывают через 5-6 ч инкубации чашек при 37°С, просматривая их под малым увеличением микроскопа. В более поздние сроки через 12-24 ч просматривают чашки невооруженным глазом. В случае положительного результата на месте нанесения капли бактериофага наблюдается полный или частичный лизис колоний в виде «бляшек».

Наличие капсулы in vitro выявляют путем посева культур на 1%-ный бикарбонатный агар или среду ГКИ. Инкубацию на 1% бикарбонатном агаре проводят при 37°С в анаэростатах при содержании 5-50% CO₂ или в эксикаторе с притертой крышкой. На дно эксикатора (на каждый литр объема) насыпают 0,4 г пищевой соды NaHCO₃ и наливают 0,35 мл концентрированной соляной кислоты НС1 или 2 г пищевой соды+ 10 мл 20%-ной серной кислоты H₂SO₄. После внесения чашек Петри с посевами эксикатор закрывают крышкой и слегка наклоняют, соединяя соду с кислотой. Просматривают посевы через 18-24ч. Капсулообразующие культуры вырастают в виде крупных гладких блестящих слизистых колоний. В мазках, окрашенных после их фиксации одним из методов (по Ребигеру, капсульно-соматической сибиреязвенной люминесцентной сывороткой), видны цепочки палочек, окруженных хорошо выраженной капсулой.

Жидкая питательная среда ГКИ для обнаружения капсулообразования сибиреязвенной бациллы состоит из 40% инактивированной бычьей или лошадиной сыворотки и 60% раствора Хенкса. Пробирки с посевами закрывают стерильными резиновыми пробками и помещают в термостат при 37°С. Через 30-120 мин инкубирования у отдельных клеток начинается капсулообразование, а спустя 16-18 ч все или большинство клеток образуют капсулу. Для выявления капсулообразования из посевов делают мазки, их фиксируют и окрашивают одним из методов окраски капсулы. В мазках видны длинные цепи палочек, окруженных капсулой.

При вскрытии биопробных животных, которым введена исследуемая культура, делают мазки перитонеального экссудата и крови из сердца, а также мазки-отпечатки из органов. Мазки фиксируют и окрашивают по Ребигеру или метиленовым синим. В мазках материала от животных микробы расположены короткими цепочками, попарно или поодиночке, окружены розовой капсулой. Способность к капсулообразованию in vivo из всех представителей рода Bacillus присуща только возбудителю сибирской язвы. Встречающиеся в природе атипичные штаммы, не образующие капсулу, но по другим тестам соответствующие В. anthracis, требуют дополнительных исследований.

Тест «жемчужное ожерелье». Перед постановкой пробы остуженный до 45°С 2%-ный питательный агар разливают по 10 мл в 3 пробирки. В первую пробирку добавляют пенициллин из расчета 0,5 ЕД/мл, во вторую — 0,05 ЕД/мл, в третью — антибиотик не добавляют (контрольная). Содержимое каждой пробирки выливают в чашку Петри. После застывания среды дно чашек снаружи размечают на квадраты или кружки, на которых пишут номера анализа. На обозначенные участки наносят по одной капле изучаемых 5-6-часовых бульонных культур. На одной чашке может быть поставлено до 10 проб. Посевы инкубируют при 37°С. Не позже чем через 3 ч просматривают рост с сухой (х 40) и иммерсионной (х 90) системами под микроскопом, предварительно накрыв каждый отмеченный участок покровным стеклом. На среде, содержащей пенициллин, видны шарообразные формы бактериальных клеток, расположенных в виде цепочек, напоминающих ожерелье из жемчуга. Спорообразующие сапрофиты, как правило, устойчивые к пенициллину, образуют на среде с пенициллином обычные формы микробов. В контрольной чашке без пенициллина сибиреязвенная бацилла формирует длинные цепи палочек.

Модификация теста «жемчужное ожерелье». К бульону Хоттингера (pH 7,2-7,3) добавляют стерильно 20% инактивированной лошадиной сыворотки, 0,05 и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Среды разливают с соблюдением стерильности в пробирки по 2-3 мл и высевают на них по 2 капли бульонной или петлю агаровой культуры, взятой для исследования. Пробирки с посевами инкубируют не более 3 ч при 37°С. Затем делают мазки, фиксируют их и окрашивают по Ребигеру или метиленовым синим.

Подвижность. Возбудитель сибирской язвы неподвижен, чем отличается от большинства спорообразующих сапрофитов. Подвижность устанавливают в «висячей капле» или при посеве уколом в полужидкий агар. В полужидком агаре рост В. anthracis наблюдается только по ходу укола. Посевы выдерживают в термостате при 37"С 18-20 ч.

Тест на гемолиз. Для проведения этого теста готовят МПА или агар Хоттингера (pH 7,2-7,3) с 3-5% дефибринированной крови барана. Посевы лучше делать петлей секторами. Выдерживают в термостате при 37°С в течение 18-20 ч, после чего учитывают результат. В эти сроки сибиреязвенный микроб не вызывает гемолиза крови барана в отличие от родственных спорообразующих сапрофитов, образующих широкую зону гемолиза вокруг выросших колоний.

Тест на лецитиназу. Наличие или отсутствие лецитиназной активности определяют в жидкой желточной среде или на агаре Хоттингера, в который добавлен стерильно желток куриного яйца. В пробирки с 5 мл жидкой желточной среды засевают петлей суточную культуру и инкубируют в термостате при 37°С. Возбудитель сибирской язвы, как правило, в течение нескольких суток инкубирования не свертывает желток, в то время как представители спорообразующих сапрофитов свертывают желток уже в первые сутки. На плотной питательной среде с желтком возбудитель сибирской язвы растет, не образуя вокруг колоний мутной белой зоны. Вокруг колоний большинства сапрофитов, вырабатывающих активную лецитиназу, просматривается широкая зона коагуляции желтка.

- Читать далее "Экспресс-диагностика возбудителя сибирской язвы (B. anthracis)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 21.12.2019