Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) ставится с целью выявления противоси-биреязвенных антител в сыворотке больных людей. Для непрямого метода РИФ используют диагностическую антивидовую сыворотку против иммуноглобулинов человека — люминесцируютцую сухую. Для получения молодого вегетативного роста сибиреязвенной культуры используют споры вакцины СТИ, которые засевают на чашки с агаром Хоттингера (pH 7,2-7,4) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 18-20 ч. После этого готовят суспензию вегетативных клеток на физиологическом растворе но оптическому стандарту мутности на 10 ед. Полученную суспензию тщательно встряхивают и готовят из нее мазки на хорошо обезжиренных предметных стеклах, по 8 мазков на каждом стекле. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют 30 мин в спирте с 3% перекиси водорода, вновь высушивают и расчерчивают восковым карандашом. При постановке этой реакции желательно использовать «свежие» мазки, при необходимости их можно хранить в холодильнике в закрытых чашках Петри в течение 3 сут.

Исследуемую сыворотку от больного человека инактивируют на водяной бане при 56"С в течение 20 мин. Затем сыворотку титруют в пробирках или полистироловых планшетах на физиологическом растворе с двукратным шагом, отбирают при помощи пастеровской пипетки, начиная с большего разведения, и наносят каплю на мазки с вегетативной культурой возбудителя сибирской язвы. Стекла помещают на дно чашки Петри. Закрывают крышкой и выдерживают 20-30 мин при 37°С. Затем мазки промывают дважды по 10 мин в забуференном физиологическом растворе и в дистиллированной воде. Стекла сушат на воздухе при комнатной температуре, после чего на мазки наносят люминесцирующую сыворотку против иммуноглобулинов человека в рабочем титре, обозначенном на ампуле. Мазки окрашивают и промывают, так же как и в первом случае. Микроскопию проводят под иммерсионной системой. Для оценки интенсивности свечения используют четырехкрестовую систему. Положительной считается свечение на 3+ и 4+.

У лиц, больных сибирской язвой, специфические антитела начинают появляться уже с 5-х суток после начата болезни, и их количество увеличивается до 21 суток и более. Увеличение титра антител можно проследить при исследовании парных сывороток с интерватом 5-7 дней. В РИФ титры антител могут доходить до 1:640 — 1:1280, диагностическим титром считаются титры 1:16 — 1:32.

а) Кожно-аллергическая проба с сибиреязвенным аллергеном антраксином. Организм больного и переболевшего сибирской язвой обладает свойством отвечать аллергической реакцией в виде гиперемии и инфильтрата кожи на месте введения сибиреязвенного аллергена — антраксина. Эта реакция может появляться уже с первых дней заболевания и наблюдается у подавляющего числа больных с конца первой недели болезни. Аллергическая перестройка организма у переболевших сибирской язвой может сохраняться длительное время, что позволяет использовать антраксин не только для диагноза текущего заболевания, но и для постановки ретроспективного диагноза.

Антраксин вводят с соблюдением всех правил асептики строго внугрикожно в количестве 0,1 мл в кожу нижней трети левого предплечья на внутренней стороне. В месте введения антраксина через 24-48 ч учитывается наличие гиперемии и инфильтрата. В зависимости от размеров этих элементов производят оценку пробы, руководствуясь проведенной шкалой.

Диагноз сибирской язвы подтверждается положительной антраксиновой пробой с оценкой от 2+ до 4+. При сомнительном (±) или слабоположительном (+) результате пробу повторяют через 5-7 дней. Отрицательная реакция на антраксин не исключает диагноза сибирской язвы.

б) Молекулярно-генетические методы исследования. Использование ПЦР для идентификации и внутривидовой дифференциации В. anthracis. С этой целью можно использовать тест-систему для выявления ДНК В. anthracis pXOl методом полимеразной цепной реакции производства РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов) и тест-систему АмплиСенс B.anthracis СибДиф производства ООО «Интерлабсервис» AmpliSens biotechnologies ЦНИИЭ (Москва). Исследование проводится в соответствии с инструкцией изготовителя.

в) Результаты лабораторного исследования на сибирскую язву. После проведения соответствующих этапов лабораторного исследования на сибирскую язву в определенные сроки можно давать следующие заключения о его результатах. В расчетные сроки не включено время, необходимое для подготовки проб.

1. Ориентировочные (сигнальные). При исследовании патологического материала от людей и животных — через 4-5 ч:
- по результатам микроскопии и МФА;
- после получения результатов ПЦР;
- после получения результатов РИФ с сывороткой больных;
- после постановки реакции преципитации по Асколи.

При исследовании секционного материала от трупов людей и животных, а также кож, шкур, шерсти, мяса и мясопродуктов:
- через 4-5 ч — после постановки реакции преципитации по Асколи;
- через 4-5 ч — после получения результатов МФА с антиспоровой люминесцентной сывороткой;
- через 8 ч — по результатам ИЦР.

При исследовании материала из объектов внешней среды:
- через 4-5 ч — после получения результатов МФА с антиспоровой люминесцентной сывороткой;
- 2 через 8ч — после получения результатов ПЦР.

2. Предварительные. При исследовании любого материала, подозрительного на зараженность возбудителем сибирской язвы — через 18-20 ч на основании:
- морфологии колоний на дифференциально-диагностической среде;
- результатов ПЦР с материалом из колоний;
- результатов теста на щелочную фосфатазу;
- морфологии микроба в мазках, приготовленных из выросших на питательном агаре колоний с отрицательными результатами теста на щелочную фосфатазу;
- результатов МФА при окраске люминесцентной соматической сибиреязвенной сывороткой.

3. Окончательные. При исследовании любого материала, подозрительного на зараженность возбудителем сибирской язвы — через 48-72 ч на основании:
- морфологии колоний на питательных средах, в том числе и дифференциально-диагностической, и на МПБ;
- морфологии в мазках из выросших подозрительных колоний, МПБ;
- патологоанатомической картины у забитых на вторые—третьи сутки или павших белых мышей, обнаружения капсулы в мазках-отпечатках из органов биопробных животных и морфологии колоний при посеве органов на питательном агаре;
- роста колоний на 1%-ном содовом агаре и морфологии клеток в мазках, приготовленных из колоний или взвеси микробов, выросших на жидкой среде ГКИ;
- результатов теста с сибиреязвенным бактериофагом;
- результатов теста на щелочную фосфатазу;
- результатов теста на гемолиз на агаре с дефибринированной кровью барана;
- результатов теста на лецитиназу;
- результатов теста на подвижность;
- результатов теста «жемчужное ожерелье»;
- результатов аллергической реакции с антраксином (через 24 и 48 ч).

Диагноз сибирской язвы у человека считают установленным при наличии соответствующей клинической картины, эпидемиологического анамнеза, подтвержденных одним из ниже перечисленных способов:
— выделение из патологического материала культуры В. anthracis и гибель хотя бы одного из двух зараженных лабораторных животных и выделение из его органов культуры со свойствами, характерными для возбудителя сибирской язвы;
— гибель хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных исходным материалом с последующим выделением из его органов культуры В. anthracis
— выделение вирулентной культуры В. anthracis из предполагаемого источника или фактора передачи;
— положительная антраксиновая проба.

Если по прошествии 72 ч положительные результаты не получены, окончательное заключение может быть сделано не ранее чем через 10 сут. после заражения биопробных животных.

- Читать далее "Лечение и профилактика сибирской язвы"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.12.2019