Плотные дифференциально-диагностические селективные среды энтеробактерий

1. Среда Эндо. Среда предназначена для выделения из клинического и другого материала патогенных бактерий кишечной группы.

Состав:
Агар мясопептонный — 1000,0 мл
Лактоза — 10,0 г
Фуксин основной, спиртовой насыщенный раствор — около 10,0 мл
Натрия сульфит (Na2SO3), 10%-ный водный раствор — 100,0 мл pH 7,4

Мясопептонный агар расплавляют, устанавливают pH до 7,4 и охлаждают до 70°С. В горячий растопленный агар добавляют 10,0 г лактозы, предварительно растворенной в стерильной дистиллированной воде и прокипяченной.

В отдельных колбах приготовляют:
— 10,0 мл спиртового насыщенного раствора основного фуксина;
— 100,0 мл 10%-ного водного раствора сульфита натрия.

К раствору сульфита натрия малыми дозами доливают раствор основного фуксина до тех пор, пока он не приобретет бледно-розовый цвет.

Приготовленную смесь вливают в 1000,0 мл растопленного агара, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет. Среду желательно готовить в день ее использования.

Сульфит натрия и основной фуксин оказывают подавляющее действие на большинство грамположительных микроорганизмов и одновременно служат индикаторной системой.

Грамотрицательные бактерии кишечной группы, способные ферментировать лактозу в зоне своего роста, смещают pH среды в кислую сторону вследствие образования конечного продукта расщепления — ацетилальдегида. Последний, реагируя с сульфитом натрия, способствует восстановлению фуксина с появлением красного окрашивания, поэтому лактозоположительные бактерии вырастают в виде ярко-розовых и красных колоний, часто с металлическим блеском.

Колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, образуют на этой среде прозрачные, бесцветные колонии, иногда с розовым оттенком.

В приготовлении среды большое значение имеет качество сульфита натрия. Он должен быть безводным, поэтому хранят его в герметически укупоренной посуде. Если сульфит некристаллический, его надо перекристаллизировать или прокалить в сушильном шкафу. В последнем случае сульфит приобретает вид аморфного порошка, хорошо сохраняется, но для приготовления среды берут 20%-ный раствор.

2. Агар с эозином и метиловым синим (среда Левина, ЭМС-агар). Агар с эозином и метиленовым синим Левина рекомендован для выделения энтеробактерий, включая колиформные микроорганизмы.

Состав:
Агар мясопептонный — 1000,0 мл
Лактоза (или сахароза) — 20,0 г
Метиленовый синий, 0,5%-ный водный раствор — 20,0 мл
Эозин желтый (эозин натрий, бактериологический),
2%-ный водный раствор — 15,0 мл
Калия гидрофосфат (K2HPO4*3H2O) — 2,0 г
pH 7,3±0,1

К 1000,0 мл расплавленного МПА добавляют последовательно 20.0 мл раствора метиленового синего, предварительно подогретого на водяной бане, 15.0 мл эозина желтого, 20,0 г лактозы (или сахарозы) и 2,0 г калия гидрофосфата. Растворы красок готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром в течение 1 ч и используют по мере надобности.

Углевод и калия гидрофосфат перед добавлением к агару разводят в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и кипятят в пробирке.

После добавления всех ингредиентов среду перемешивают и стерильно разливают в чашки Петри. Среда имеет красно-фиолетовый цвет.

Основным дифференцирующим фактором является способность среды изменять pH под действием кислоты, образующейся при ферментации бактериями лактозы или сахарозы. Комплекс индикаторов (эозин и метиленовый синий) выпадает в осадок при pH 4,7, окрашивая колонии кислотообразующих бактерий в темный сине-фиолетовый, почти черный цвет, часто с зеленым блеском.

Бактерии, не ферментирующие углеводы, входящие в состав среды, образуют бесцветные или розоватые колонии.

Коммерческий ЭМС-агар выпускают в сухом виде. Состав и способ приготовления среды указаны на этикетке.

3. Бактоагар «Ж» Плоскирева, сухой. Состав, г/л:
Гидролизат кильки панкреатический — 16,0
Натриевые соли желчных кислот — 8,1
Лактоза — 7,6
Натрия фосфат двузамещенный — 2,25
Натрия цитрат — 8,82
Натрия тиосульфат — 6,86
Йод металлический — 0,12
Натрия карбонат — 1,42
Нейтральный красный — 0,04
Бриллиантовый зеленый — 0,02
Агар микробиологический — 8,75
pH 7,2±0,1

Навеску препарата, указанную на этикетке, растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят 1-2 мин до полного расплавления агара, разливают в чашки Петри слоем 4,0-5,0 мм и оставляют чашки приоткрытыми на 40-50 мин при температуре 20-25°С для застудневания и подсушивания содержимого.

Готовая среда коричнево-красноватого цвета. В состав среды входят ингибирующие вещества: натриевые соли желчных кислот, йод, бриллиантовый зеленый, подавляющие рост грамположительных микроорганизмов, задерживающие в первые сутки культивирования рост Echerichia coli и колиформных бактерий, подавляющие роение протея.

Дифференцирующие свойства среды основаны на изменении pH в кислую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, образующих колонии брусничного цвета (индикатор — нейтральный красный).

Лактозоотрицательные бактерии растут в виде бесцветных или слабоокрашенных колоний.

Ростовые свойства среды недостаточны для роста S. dysenteriae и некоторых сальмонелл (S. choleraesuis, S. pullorum).

4. SS-arap (сухой). Среда предназначена для селективного и дифференциального выделения сальмонелл и шигелл.

Состав:
Гидролизат рыбной муки панкреатический — 16,0 г
Экстракт дрожжей пекарских — 5,0 мл
Желчь очищенная сухая — 7,5 г
Натрия тиосульфат Na2S2O3 — 10,0 г
Железа (III) цитрат — 1,0 г
α-D-лактоза — 10,0 г
Нейтральный красный — 0,04 г
Бриллиантовый зеленый — 0,00033 г
Агар — 10,0 ±2,0
pH 7,1 ±0,2

Навеску сухой среды, указанную на этикетке, тщательно размешивают в 1000,0 мл дистиллированной воды. Смесь при периодическом помешивании нагревают до кипения. Кипятят в течение 3 мин, до полного расплавления агара. Затем среду охлаждают до 45-50°С и разливают в нестерильные чашки Петри слоем 5,0-6,0 мм. Оставляют для застудневания агара, полуприкрыв крышками на 15-20 мин для подсушивания. Перед посевом чашки со средой подсушивают на рабочем столе с открытыми крышками в течение 90-100 мин при температуре 18-25°С.

На SS-агар можно сеять непосредственно фекалии, материал с ректальных тампонов и другой клинический материал, подозрительный на содержание патогенных энтеробактерий. Параллельно рекомендуется производить высев на чашки с менее сильным ингибиторами, например, на дезоксихолат-цитратный агар, для облегчения выделения шигелл.

Учет результатов проводят через 18 —20 ч инкубации при 36-38°С. Лактозоотрицательные патогенные и условно-патогенные энтеробактерии образуют на SS-агаре бесцветные колонии диаметром 1,0-2,0 мм в S-форме в течение 18-38 ч инкубации в термостате. Лактозоположительные условно-патогенные энтеробактерии образуют колонии диаметром 1,5-2,5 мм малинового цвета в S-форме. Штаммы, продуцирующие сероводород, образуют колонии с темным центром. Коммерческая среда выпускается отечественными и зарубежными фирмами.

5. Дезоксихолатный агар с бромкрезоловым пурпурным (агар ДБКП), HiMedia, B.C.P.-Deoxycholate Agar. Агар ДБКП является дифференциальной питательной средой, содержащей лактозу и сахарозу; предназначена для выделения грамотрицательных энтеробактерий, не ферментирующих лактозу и/или сахарозу.

Состав, г/л:
Триптон — 7,5
Пептон — 7,5
Лактоза — 10,0
Сахароза — 10,0
Экстракт дрожжевой — 2,0
Натрия цитрат — 2,0
Натрия дезоксихолат — 1,0
Натрия хлорид — 5,0
Агар — 14,0
Бромкреозоловый пурпурный — 0,02
pH 7,2±0,2

Суспендируют 59,0 г среды в 1000,0 мл дистиллированной воды. Нагревают до кипения. Затем продолжают нагрев до полного растворения частиц. Если среду предполагается использовать в тот же день, стерилизации не требуется. Если среда подлежит хранению, ее стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 15 мин. Среду охлаждают до 55-60°С, а затем разливают в чашки Петри. Колонии, не ферментирующие лактозу и/или сахарозу, — прозрачные, бесцветные или голубоватые. Кишечные палочки, ферментирующие оба углевода, образуют желтые матовые колонии, окруженные зоной деоксихолатного осадка.

6. Дезоксихолат-цитратный агар с лактозой и сахарозой, HiMedia, В.С.Р. - D.C.L.S. Agar. Среда предназначена для выделения шигелл и сальмонелл, включая группу Arizona, может быть использована для выращивания S. pullorum и S. gallinarum.

Состав, г/л:
Перевар животной ткани пептический — 5,0
Гидролизат казеина — 5,0
Экстракт дрожжевой — 3,0
Экстракт мясной — 3,0
Лактоза — 7,5
Сахароза — 7,5
Натрия цитрат —10,0
Натрия хлорид — 5,0
Натрия тиосульфат — 5,0
Натрия дезоксихолат — 2,5
Бромрезоловый пурпурный — 0,02
Агар — 14,0
pH 7,2±0,2

Смесь перечисленных ингредиентов в количестве 67,5 г суспендируют в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят, активно помешивая до полного растворения частиц. Не стерилизуют и не перегревают! Охлаждают до 45°С и разливают в чашки Петри.

Готовая среда имеет лиловую окраску, прозрачна или слегка опалесцирует. Питательные вещества в среде содержатся в таких компонентах, как пептический перевар животной ткани, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, мясной экстракт. Сахароза и лактоза являются ферментируемыми сахарами. Колонии колиформных бактерий и протеев, быстро ферментирующих сахарозу и/или лактозу, становятся желтыми (индикатор бромкрезоловый пурпурный). Это позволяет легко отличить их от почти бесцветных колоний шигелл и сальмонелл.

Цитрат и дезоксихолат подавляют рост колиформных и грамположительных микроорганизмов.

- Читать далее "Среды для идентификации энтеробактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 27.2.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.