К роду Listeria принадлежит несколько видов, из которых только один — L. monocytogenes — является возбудителем заболевания у человека. Диагностика листериоза основывается на выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации.

а) Среды обогащения:

1. Среда обогащения для листерий (среда UVM), HiMedia, Listeria Enrichment Medium (UVM Medium). Среду используют для селективного культивирования и выделения L. monocytogenes из клинического материала.

Состав, г/л:
Гидролизат казеина — 5,0
Протеозопептон — 5,0
Экстракт мясной — 5,0
Экстракт дрожжевой — 5,0
Натрия хлорид — 20,0
Калия дигидроортофосфат — 1,35
Натрия гидроортофосфат — 12,0
Эскулин — 1,0
Кислота налидиксовая — 0,02
pH 7,4±0,2

Суспендируют 54,37 г порошка в 1000,0 мл дистиллированной воды. Подогревают до кипения для полного растворения частиц. Устанавливают pH. Разливают в различные емкости. Стерилизуют при 121°С 15 мин. Остужают до 50°С, асептически добавляют стерилизованный фильтрованием раствор акрифлавина гидрохлорида (до конечной концентрации 12 или 25 мкг/мл).

Эту среду рекомендуют в качестве первичной среды обогащения. Гидролизат казеина, протеозопептон, дрожжевой и мясной экстракты являются источником необходимых питательных веществ для роста листерий. Эскулин придает среде дифференцирующие свойства. Налидиксовая кислота и акрифлавин подавляют рост соответственно грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, что наряду с повышенной концентрацией фосфата придает среде селективные свойства по отношению к листериям.

Готовая среда имеет янтарную окраску, слегка опалесцирует с голубоватым оттенком.

2. Бульон обогащения для листерий (двухкомпонентная среда), HiMedia, Listeria Enrichment Broth (Twin Pack). Среда состоит из двух частей: А и Б.

Суспендируют 26,0 г порошка части А или 39,0 г порошка части А и 37,5 г порошка части Б в 1000,0 мл дистиллированной воды. Подогревают до кипения для полного растворения частиц. Стерилизуют при 121°С 15 мин. Исследуемые образцы засевают в бульон обогащения.

Гидролиз казеина и пептический перевар животной ткани являются источником необходимых питательных веществ для роста листерий. Роданид и налидиксовая кислота подавляют рост грамотрицательных бактерий.

Готовая среда имеет желтую окраску, прозрачна или слегка опалесцирует в пробирках и чашках Петри. Среда с агаром гелеобразна. Через 48 ч инкубации при 37°С в условиях атмосферы, содержащей 10% С(>2, производят высев на кровяной агар для получения изолированных колоний.

б) Среды для выделения и идентификации листерий:

1. Питательный агар для выделения и идентификации листерий (ПАЛ) (ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск).

Состав основы среды, г/л:
Гидролизат казеина панкреатический — 10,0
Гидролизат рыбной муки панкреатический — 15,0
Гидролизат автолизованных дрожжей — 2,0
Хлорид натрия — 3,5
Хлорид лития — 15,0
Цитрат аммонийного железа — 0,5
Эскулин — 0,8
Агар — 13,0
pH 7,0±0,2

Компоненты растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают до полного растворения. Устанавливают pH 7,0±0,2 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

К 1 л стерильной расплавленной основы среды добавляют с соблюдением правил асептики 4,44 мл раствора селективных компонентов. Раствор готовят следующим образом: 0,02 г налидиксовой кислоты, 0,01 г полимиксина В сульфата и 0,01 г акрифлавина растворяют в 10,0 мл стерильной дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Приготовленную питательную среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят не более 22 сут. в защищенном от света месте при температуре не выше 8°С.

2. Дрожжевой триптон-соевый агар/Дрожжевой триптон-соевый бульон, HiMedia, Tryptone Soya Yeast Extract Agar/Broth. Эта среда рекомендована для обогащения и выделения листерий.

Суспендируют 51,0 г порошка агара или 36,0 бульона в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения частиц. Устанавливают pH. Разливают в пробирки, флаконы. Стерилизуют при 121°С 15 мин.

Гидролизат казеина и папаиновый перевар соевой муки являются источником аминокислот и других питательных веществ, необходимых для роста микроорганизмов. Глюкоза служит источником энергии. Фосфат придает среде буферные свойства. Дрожжевой экстракт является богатым источником витаминов группы В.

Колонии листерий на дрожжевом триптон-соевом агаре выглядят плотно-белыми или радужно-белыми, напоминая битое стекло. Колонии других микроорганизмов — желтоватые или оранжевые.

Готовая среда имеет желтый цвет, прозрачна.

3. Агар для выделения и идентификации листерий (PALCAM), HiMedia, Listeria Identification Agar (PALCAM).

Состав, г/л:
Пептон — 23,0
Крахмал — 1,0
Натрия хлорид — 5,0
Маннит — 10,0
Железа аммонийного цитрат — 0,5
Эскулин — 0,8
Глюкоза — 0,5
Лития хлорид — 15,0
Феноловый красный — 0,08
Агар — 13,0
pH 7,0±0,2

Суспендируют 69,0 г порошка в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения среды. Стерилизуют при 121°С 15 мин. Охлаждают до 50°С и асептически добавляют регидратированное содержимое селективной добавки для листерий.

4. Селективная добавка для листерий (PALCAM), HiMedia, Listeria Selective Supplement PALCAM. Антимикробная добавка рекомендуется для селективного выделения и идентификации Listeria monocytogenes.

Состав (на флакон для 500,0 мл среды):
Полимиксин В — 50 000 ЕД
Цефтазидим — 10,0 мл
Акрифлавина гидрохлорид — 2,5 мг

Растворяют содержимое флакона в 5,0 мл стерильной дистиллированной воды, асептически добавляют в 500,0 мл стерильной расплавленной среды PALCAM. Хорошо перемешивают и разливают среду в стерильные чашки Петри.

Внимание! Хлорид лития опасен. Избегайте контакта с кожей. При попадании его на кожные покровы следует немедленно обильно промыть их водой.

PALCAM - агар для идентификации листерий высокоселективен из-за наличия в нем хлорида лития, цефтазидима, полимиксина В и акрифлавина.

PALCAM — дифференциально-диагностическая среда, содержит две индикаторные системы: эскулиновую и маннитовую.

L. monocytogenes гидролизует эскулин на эскулетин и глюкозу. В реакции с цитратом железа эскулетин образует коричневый комплекс, что приводит к потемнению среды вокруг колонии.

Листерии не ферментируют маннит, поэтому сбраживающие маннит энтерококки и стафилококки формируют колонии цветом от желтого до красного. Микроаэро-фильные условия культивирования ограничивают рост аэробов, подобных представителям родов Bacillus и Pseudomonas.

Готовая среда имеет красную окраску, прозрачная, слегка опалесцирующая.

5. Основа Оксфордской среды для листерий, HiMedia, Listeria Oxford Medium Base. Основа Оксфордской среды с добавками рекомендуется для выделения Listeria из патологического материла.

Состав, г/500 мл:
Пептон специальный - 23,0
Лития хлорид - 15,0
Натрия хлорид - 15,0
Крахмал кукурузный - 1,0
Эскулин - 1,0
Железа аммонийного цитрат - 0,5
Агар - 10,0
pH 7,0±0,2

Суспендируют 27,75 г среды в 500,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения среды. Стерилизуют при 121°С 15 мин.

Охлаждают до 50°С и асептически добавляют регидратированное содержимое селективной добавки для выделения листерий. Тщательно перемешивают и разливают среду в стерильные чашки Петри.

6. Селективная добавка к Оксфордской среде для выделения листерий, HiMedia, Oxford Listeria Supplement.

Состав, на 500,0 мл:
Циклогексимид — 200,0 мг
Колистина сульфат — 10,0 мг
Акрифлавина гидрохлорид — 2,5 мг
Цефотетан — 1,0 мг
Фосфомицин — 5,0 мг

Регидратируют содержимое флакона в 5,0 мл 50%-ного этанола. Смесь встряхивают, чтобы растворилась, и асептически добавляют к 500,0 мл стерильной расплавленной основы Оксфордской среды. Готовую смесь разливают в стерильные чашки Петри. Среда предназначена для выделения L. monocytogenes из клинического материала. Хлорид лития и антибиотики подавляют рост грамотрицательной микрофлоры. L. monocytogenes гидролизует эскулин на эскулетин и глюкозу. Реагируя с цитратом железа, образует коричнево-черный комплекс, что приводит к потемнению среды вокруг колоний.

Методика выделения листерий на этой среде зависит от исследуемых образцов. Фекальные и биологические образцы гомогенизируют в 0,1%-ной пептонной воде и 0,1 мл полученной взвеси высевают на Оксфордский агар (или бульон для селективного обогащения листерий, инкубируют при 30°С 7 сут., после чего высевают на селективную среду).

Готовая среда имеет темно-янтарную окраску с голубоватым отблеском.

7. Среда ГРМ-1 для определения лецитиназной активности листерий, сухая (ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск).

Состав, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки — 15,0
Экстракт пекарских дрожжей — 10,0
или
Экстракт дрожжевой (импортный) — 2,0
Натрия хлорид — 3,5
Глюкоза — 1,0
Агар — 10,0

Препарат в количестве, указанном на этикетке, размешивают в 1000,0 мл дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

В полученный фильтрат среды ГРМ-1 добавляют активированный уголь, растертый до порошкообразного состояния, до концентрации 0,5% (масса/объем), стерилизуют при 121°С 20 мин. Желток куриного яйца разводят в 150 мл изотонического раствора хлорида натрия и добавляют 5% по объему к стерилизованному и охлажденному до 45°С агару ГРМ-1. Среду разливают в чашки Петри, но не более 20 мл на чашку, и подсушивают при 37°С. Аналогично готовят среду с добавлением желтка, но без активированного угля. Исследуемые штаммы засевают короткими штрихами на обе среды и инкубируют 48 ч.

Питательную основу (панкреатические гидролизаты и дрожжевой экстракт) можно заменить сердечно-мозговым бульоном фирмы «Difco».

- Читать далее "Среды для выделения, культивирования и идентификации микобактерий туберкулеза"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 27.2.2020