Среды для выделения, культивирования и идентификации микобактерий туберкулеза

а) Среда Лененштейна-Иенсена. Состав:

1. Раствор минеральных солей:
Калий однозамещенный фосфорнокислый KH2PO4 — 2,4 г
Магний сернокислый MgSO4 * 7H2O — 0,24 г
Магний лимоннокислый — 0,6 г
L-аспарагин — 3,6 г
Глицерин — 12 мл
Вода дистиллированная — 600,0 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Затем стерилизуют в автоклаве 30 мин при 121°С. Срок хранения раствора — 3-4 нед. при комнатной температуре.

2. Раствор малахитового зеленого:
Малахитовый зеленый — 2,0 г
Стерильная дистиллированная вода — 100,0 мл

Растворить в стерильной дистиллированной воде малахитовый зеленый, поместив раствор в термостат на 1-2 ч. При необходимости профильтровать через бумажный фильтр. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его следует заменить свежим раствором. Стерилизовать при 121°С 30 мин.

3. Яичная масса. Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 сут. без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде при помощи ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70° этиловый спирт на 30 мин. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20-25 яиц в зависимости от их величины). Тщательно взбивают стерильным венчиком или в стерильном миксере.

4. Приготовление. В большую стерильную емкость, соблюдая правила асептики, помещают следующие растворы:
раствор минеральных солей — 600,0 мл
гомогенизированную яичную массу — 1000,0 мл

Тщательно перемешивают и фильтруют через 4-слойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 20,0 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 мин разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не сформировался осадок.

Свертывание среды. Для свертывания среды используют специальные аппараты — свертыватели типа АСИС. Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной среды. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85°С в течение 45 мин. Приготовление питательной среды проводится в условиях соблюдения асептики, так как свертывание является не стерилизующей, а лишь коагулирующей процедурой.

Качество приготовленной яичной среды зависит от соблюдения температурного и временную режимов коагуляции. Обесцвечивание среды, наличие пузырьков или углублений на ее поверхности свидетельствует о нарушении режима свертывания. Повторное свертывание также ухудшает качество среды. Среды, приготовленные с нарушением режима свертывания, подлежат уничтожению.

б) Среда Финн-П. Состав среды:

1. Раствор минеральных солей:
Магний сернокислый MgSO4 * 7H2O — 0,5 г
Натрий лимонно-кислый С6H3O7Na x 5,5H2O — 0,1 г
Квасцы железо-аммонийные Fe(NH4)*(SO4) х 12Н2O — 0,05 г
Калийоднозамещеныйй фосфорнокислый KH2PO4 — 20,0 г
Аммоний лимонно-кислый однозамещенный C8H11O7N — 5,0 г
Натрий глутаминово-кислый однозамещенный — 10,0 г
Глицерин — 20,0 мл
Вода дистиллированная — до 1000,0 мл

2. Раствор малахитового зеленого, водный, 2%-й, профильтрованный через бумажный фильтр

3. Яичная масса. Все минеральные соли растворяют в воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения!) на водяной бане. Стерилизовать при 120°С — 20 мин. Хранить не дольше 3-4 нед при комнатной температуре.

Приготовление раствора малахитового зеленого — так же, как и для среды Левенштейна-Йенсе на (см.выше.)

Приготовление яичной массы — так же, как для среды Левенштейна-Йенсена. Приготовление готовой среды, ее свертывание и хранение — так же, как и среды Левенштейна-Йенсена.

в) Среда Школьниковой. Состав среды:
Калий однозамещенный фосфорнокислый KH2PO4 — 1,5 г
Натрий двузамещенный фосфорнокислый Na2HPO4 — 2,5 г
Магний сернокислый MgSO4 x 7H2O — 0,5 г
Натрий лимоннокислый — 1,5 г
Лимоннокислое аммиачное железо — 0,05 г
L-аспарагин — 1,0 г
Глицерин — 30,0 мл
Вода дистиллированная — до 1000,0 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Среду фильтруют через бумажный фильтр и разливают в колбы. Кислотность среды не корригируют, так как она содержит буферную смесь солей, pH среды 7,0-7,2.

Стерилизуют в автоклаве 30 минут при 1 атмосфере (121°С). Срок хранения среды составляет 2-3 месяца при комнатной температуре.

г) Дифференциально-диагностические среды для идентификации М.tuberculosis:

1. Среда Левенштейна-Йенсена с паранитробензойной кислотой (ПНБК). Состав:
Среда Левенштейна-Йенсена (до свертывания) — 95,0 мл
Паранитробензойная кислота — 50,0 мг
4%-ный раствор гидроокиси натрия NaOH — 20-24 капли
pH - 7,0

Навеску ПНБК хорошо растереть в стерильной ступке, добавить 5,0 мл дистиллированной стерильной воды и 20-24 капли 4%-ного раствора едкого натра до pH - 8,0 (по индикаторной бумажке). Затем с помощью 10%-ного раствора соляной кислоты довести pH до 7,0. Приготовленный раствор добавить к 95,0 мл среды Левенштейна-Йенсена, тщательно размешать. Опытную и контрольную (без ПНБК) среды разлить в пробирки по 5,0 мл, которые поместить в свертыватель по углом 85° и свертывать при температуре 85°С в течение 45 мин. Приготовление питательной среды проводится с соблюдением правил асептики.

2. Среда Левенштейна-Йенсена, содержащая различные концентрации салициловокислого натрия. Состав:
Среда Левенштейна-Йенсена (до свертывания) — примерно 300,0 мл
Натрий салициловокислый — 500,0 мг

Раствор №1. Приготовить навеску натрия салициловокислого и добавить к 5,0 мл дистиллированной воды.

Раствор №2. К 2,0 мл раствора № 1 добавить 2,0 мл дистиллированной воды.

Приготовленные растворы №1 и №2 в пробирках подогреть над пламенем горелки до кипения и дать остыть до комнатной температуры. По 1,0 мл каждого раствора добавить в колбы с 99,0 мл среды Левенштейна-Йенсена. В колбах создается концентрация салициловокислогого натрия 500 мкг/мл и 1000 мкг/мл. Среды с салициловокислым натрием и контрольную (без препарата) разлить в пробирки по 5,0 мл и свернуть в скошенном состоянии при 85°С в течение 45 мин. Приготовление сред производится с соблюдением правил асептики.

- Читать далее "Среды для выделения и культивирования клостридий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 27.2.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.