Менингококк относится к числу трудно культивируемых бактерий. Питательные среды с обязательным содержанием крови или нормальной сыворотки должны иметь основу, богатую аминокислотами и ростовыми факторами. Культивирование менингококка осуществляют при повышенном содержании (5-10%) CO₂ в атмосфере. Посевы материала, содержащего менингококк (или подозрительного на его содержание), производят на подогретые при 37°С питательные среды.

а) Питательные основы сред для менингококка. В качестве доступной питательной основы жидких, полужидких и плотных сред для менингококка рекомендован перевар мяса по Хоттингеру с конечным содержанием 1,5-1,7 г/л аминного азота. Из числа коммерческих питательных основ пригодны среда АГВ, Эритрит-агар, агар Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton agar), триптиказосоевый и сердечно-мозговой бульон. pH питательных основ сред для менингококка 7,3±0,1. Стерилизация при 112°С 30 мин.

б) Транспортная среда для сохранения жизнеспособности менингококка в носоглоточной слизи в течение 3 ч и дольше. В качестве транспортной среды используют стерильный питательный бульон или 2%-ную пептонную воду (pH 7,3±0,1), в которую перед выездом за материалом добавляют 0,5% рабочего раствора 1000 мкг/мл линкомицина гидрохлорида. При этом создается концентрация линкомицина 5,0 мкг в 1,0 мл среды.

Непосредственно перед взятием материала в помещении, где находятся обследуемые лица, среду (без огня) разливают по 1,0-1,5 мл в необходимое (по числу проб) количество пробирок. Взятую носоглоточную слизь на ватном тампоне погружают в среду, разогнув металлический стержень, на котором укреплен тампон. Пробирки закрывают кусочком ваты и в строго вертикальном положении транспортируют в лабораторию при температуре не ниже 20°С. В лаборатории тампоны слегка отжимают о стенки пробирок и производят высев на сывороточный агар (без линкомицина) в чашки Петри. В одной чашке Петри можно разместить 2 посева.

Для транспортировки носоглоточных проб возможно применение специальных транспортных коммерческих сред, содержащих тиогликолевую кислоту: среду Стюарта (Stuart), среду Эймиса (Amies) и др.

в) Транспортная среда Стюарта (сухая), HiMedia, Stuart Transport Medium. Транспортная среда Стюарта рекомендуется для транспортировки проб клинического материала, подозрительного на содержание нейссерий и других требовательных микроорганизмов, из клиники в лабораторию. Пробы из уха, горла, носа, влагалища или других областей с использованием стерильного тампона помещают в пробирку с транспортной средой.

Состав, г/л:
Натрия тиогликолят — 0,9
Натрия глицерофосфат — 10,0
Кальция хлорид — 0,1
Метиленовый синий — 0,002
Агар — 3,0
pH 7,4±0,2

Суспендируют 14,0 г сухой среды в 1000,0 мл дистиллированной воды. Вода не должна содержать хлора. Кипятят до полного растворения среды. Разливают в пробирки по 6-7 мл. Стерилизуют при 121°С 15 мин.

г) Полужидкий агар для посевов крови и как среда обогащения спинно-мозговой жидкости (СМЖ). К бульону, содержащему триптический гидролизат белка (бульон на переваре Хоттингера, триптиказосоевый и т.д.), добавляют 0,1% агара, устанавливают pH 7,2-7,4. Готовую среду разливают во флаконы по 50,0 мл (для посевов крови) и в пробирки по 5,0 мл (для обогащения СМЖ), стерилизуют при температуре 112°С в течение 30 мин.

д) Сывороточный агар — основная среда для выделения и культивирования менингококка. К расплавленной и охлажденной до 45°С питательной агаровой основе для менингококка добавляют 20% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота, стерильной или с консервантом — хлороформом. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри или в пробирки (для получения скошенного агара).

е) Селективная среда — сывороточный агар с линкомицином для выделения менингококка из носоглоточной слизи. К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару для менингококка добавляют 20% нормальной сыворотки и 0,5% рабочего раствора антибиотика линкомицина гидрохлорида. Рабочий раствор содержит 1000 мкг/мл линкомицина. Конечная концентрация линкомицина в среде — 5 мкг/мл. Готовую среду разливают в чашки Петри. Среду с линкомицином используют при условии одновременного посева на сывороточный агар без антибиотика, при этом селективную среду засевают первой.

Обе среды полупрозрачны и имеют кремово-желтый цвет (в зависимости от цвета питательной агаровой среды).

Чашки Петри с сывороточным агаром (с линкомицином и без него) хранят в холодильнике не более суток, пробирки со скошенным сывороточным агаром — не более 5 сут. Рабочий раствор линкомицина можно хранить в холодильнике не более 6 мес.

ж) Желточно-сывороточный агар для дифференциации менингококка и непатогенных нейссерий. Желточно-сывороточный агар предназначен для выявления способности нейссерий к образованию пигмента. К расплавленному и остуженному до 45°С питательному агару для менингококка добавляют 10% нормальной сыворотки и 20% желточной смеси. После перемешивания среду разливают в чашки Петри. Желточную смесь готовят ex tempore следующим образом. Асептически извлеченный из яйца желток помещают во флакон с 50,0 мл 0,5%-ного стерильного раствора натрия хлорида с бусами; смесь тщательно взбалтывают.

Среда непрозрачна, имеет желтый цвет. Испытуемые культуры засевают на среду в виде штрихов. После инкубации в термостате в течение 1 сут. посевы просматривают, чтобы определить образование желтого или зеленоватого пигмента. При нечетких результатах посевы оставляют при комнатной температуре на свету еще на 1 сутки.

з) Среды с углеводами для выявления сахаролитических свойств менингококка и других нейссерий. Для приготовления сред с углеводами для выявления сахаролитических свойств менингококка и нейссерий-комменсалов используют агаровые питательные основы для менингококка, содержащие один из углеводов (глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, фруктозу), а также 20% нормальной сыворотки.

Приготовление сред. К 75,0 мл расплавленной агаровой основы добавляют 0,9 г одного из углеводов и 3,9 мл раствора фенолового красного. pH смеси 7,5+0,1. Среды стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной до 45°С среде добавляют 20% нормальной сыворотки; смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовые среды имеют розоватый цвет. На одной чашке размещают от 4 до 8 посевов штрихами испытуемых культур.

Приготовление раствора индикатора фенолового красного. 0,4 г сухого порошка фенолового красного смешивают с 16,0 мл децинормального (0,1 N) раствора гидроксида натрия NaOH и выдерживают в термостате при частом встряхивании. После полного растворения порошка раствор доливают дистиллированной водой до объема 200,0 мл, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре 121°С 20 мин.

Так как нейссерии являются слабыми кислотообразователями, то уместно для определения разложения углеводов использовать среды Хью-Лейфсона (с минимальным содержанием азотистых веществ — источников щелочных продуктов, нейтрализующих образующиеся кислоты) без применения вазелинового масла.

При разложении углевода менингококк начинает изменять цвет среды с верхней части столбика(оксидация).

При определении сахаролитических свойств менингококка все посевы инкубируют без повышенной концентрации углекислого газа!

и) Сывороточный агар с желчью для дифференциации менингококка и непатогенных нейссерий. Готовят 5%-ный раствор сухой бычьей желчи* на дистиллированной воде. Раствор фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят pH до 7,2—7,4, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд. К 80,0 мл расплавленного и остуженного до 50°С питательного агара для менингококка добавляют 4,0 мл стерильного 5%-ного раствора сухой желчи, перемешивают, добавляют 20,0 мл нормальной сыворотки животных, снова хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри. Конечная концентрация сухой желчи в среде — 0,2%. Посев испытуемых культур производят штрихами.

Если через 24 ч инкубации испытуемая культура вырастает, то ее нельзя отнести к менингококку. Отсутствие роста на желчном агаре не имеет диагностического значения.

*Коммерческие препараты жидкой желчи непригодны, так как содержат консерванты.

- Читать далее "Транспортные среды энтеробактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 27.2.2020