Гонококк относится к трудно культивируемым бактериям. Для его выращивания требуются питательные основы, богатые аминокислотами и ростовыми факторами, также обязательно добавление крови, нормальной сыворотки или куриного желтка. Культивирование происходит при высокой влажности (что достигается использованием свежеприготовленных сред) и повышенной концентрации CO₂ (5-10%) в атмосфере. В качестве питательной основы сред для гонококка рекомендован МПА, приготовленный на мясной воде с использованием мяса кролика или бычьих сердец, pH 7,3±0,1.

Возможно применение сухих коммерческих питательных основ (например, GC-агар, агар Мюллера-Хинтона и др.) с добавлением 20% нормальной сыворотки или 5% свежей крови.

а) Приготовление ватных тампонов для взятия материала на гонококк. Ватные тампоны на деревянных палочках или стержнях из нержавеющей стали (диаметром около 2,0 мм), вмонтированные в ватные пробки, окунают в фосфатный буфер (pH 7,4), кипятят в нем в течение 20 мин, после чего импрегнируют в течение 24 ч 1%-ной водной суспензией тонко измельченного активированного угля. После этого тампоны высушивают, вставляют в бактериологические пробирки диаметром, равным диаметру пробирок с транспортной средой, и стерилизуют в автоклаве при 121°С 20 мин.

б) Среда для хранения и транспортировки гонококка (среда Стюарта). Готовят две смеси.

Смесь №1:
Агар — 3,0 г
Вода дистиллированная — 1000,0 мл
Смесь нагревают до полного растворения агара.

Смесь №2:
Кислота тиогликолевая — 2,0 мл
Натрия гидроксид NaOH 1М раствор — 12,0 мл
Натрия фосфата однозамещенного (NaH₂PO₄*2H₂O)
20%-ный раствор — 100,0 мл
Хлористого кальция (CaCl₂) 1%-ный раствор — 20,0 мл
Вода дистиллированная — 900,0 мл

К смеси №1 добавляют смесь №2, доводят pH до 7,3-7,4. Полужидкую агаровую среду разливают в стерильные пробирки по 10,0 мл и стерилизуют текучим паром в течение 60 мин.

Готовую среду сохраняют в холодильнике не более суток. Применяют для транспортировки патологического материала, взятого непосредственно, на ватном тампоне, импрегнированном углем, погруженном в среду. При доставке в лабораторию тампоном производят посев на плотные среды.

в) Среда для транспортировки проб материала, исследуемого на гонококк или менингококковое носительство (среда Эймиса [Amies]). Среда содержит тиогликолят (натриевую соль меркаптоацетиловой кислоты) в качестве редуцирующего агента. При применении среды Эймиса используют обыкновенные ватные или дакроновые тампоны, не импрегнированные углем.

Состав:
Натрия хлорид (NaCl) — 3,0
Калия хлорид (KCl) — 0,2
Фосфат натрия двузамещенный (безводный) (Na2HPO/i) — 1,15 или Na₂HPO₄*12H₂O — 2,9
Фосфат калия однозамещенный (KH₂PO₄) — 0,2
Натрия тиогликолят — 1,0
Кальция хлорид (CaCl₂), 1%-ный раствор — 10,0 мл
Магния хлорид (MgCl₂*6H₂O), 1% -ный раствор — 10,0 мл
Уголь фармацевтический нейтральный — 10,0
Агар — 4,0
Вода дистиллированная — 1000,0 мл

Вначале растворяют агар в воде при подогревании. Затем в горячий раствор последовательно вносят все перечисленные ингредиенты, кроме угля. После тщательного перемешивания и полного растворения добавляют уголь. Среду быстро разливают по 6,0 мл и автоклавируют при 112°С 20 мин. После автоклавирования, прежде чем дать среде застыть, пробирки несколько раз опрокидывают для равномерного распределения угля, после чего, в случае надобности, заменяют пробки. Среду хранят в холодильнике.

г) Основа питательных сред лабораторного приготовления для выделения и культивирования гонококка (среда ЦКВИ). Питательной основой является мясопептонный агар (МПА), приготовляемый следующим образом. Готовят мясную воду: фарш из мяса кролика или бычьих сердец заливают водой (1 часть фарша и 2 части водопроводной воды) и оставляют на одни сутки при +4°С. Затем смесь кипятят 10 мин, охлаждают и фильтруют через марлю. К фильтрату добавляют 1% сухого коммерческого пептона, 0,5% натрия хлорида (NaCl) и 2% агара. pH смеси 7,4-7,6. Далее среду доводят до кипения (при помешивании), фильтруют через ватно-марлевый фильтр и мерно разливают в стерильные флаконы. Стерилизуют при 112°С 20 мин. Основу хранят в холодильнике.

д) Варианты готовых питательных сред для выделения и культивирования гонококка. Перед использованием, независимо от выбранного варианта, питательную основу расплавляют, остужают до 50-45°С и вносят в нее 20% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота, а также следующие биодобавки (на 100,0 мл питательной основы):
Вариант 1. Гидролизат казеина для парентерального белкового питания — 2,0;
Стерильный аутолизат дрожжей (или 1,5%-ный раствор ЭКД) — 2,0 мл
Вариант 2. 5%-ный раствор Гемогидролизата — 2,0 мл
Стерильный аутолизат дрожжей (или 1,5%-ный раствор ЭКД) — 2,0 мл
Вариант 3. Среда 199 для культур тканей (без антибиотиков) — 2,0 мл
Стерильный аутолизат дрожжей (или 1,5%-ный раствор ЭКД) — 2,0 мл
Вариант 4. Желток куриного яйца — 10,0 мл
Основу хорошо перемешивают с биодобавками, разливают в чашки Петри или в пробирки (скашивают!). Хранят в холодильнике не более 4-5 дней.

е) Селективная среда Тейера-Мартина для выделения гонококка из патологического материала, рекомендованная ВОЗ. В качестве основы используют сухую коммерческую среду GC-arap, или агар Мюллера-Хинтона, или питательную основу ЦКВИ, или любую пригодную для гонококка агаровую питательную основу.

К готовой питательной основе, расплавленной и охлажденной до 50-45°С, стерильно добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки или плазмы либо 5% дефибринированной крови. В качестве ингибиторов посторонней флоры в среду вносят растворы антибиотиков — ванкомицина (в конечном содержании 3 мкг/мл), колистина (10,0 мкг/мл) и нистатина (12,5 мкг/мл). Иногда смесь трех антибиотиков выпускается фирмами в виде отдельной добавки VCN (см. ниже).

Среду разливают в чашки Петри для посева нативного материала или смешанной культуры, содержащей гонококк.

ж) Селективная среда для выделения гонококка при экстрагенитальной гонорее. Селективная среда применяется для первичного посева материала с целью выделения чистой культуры гонококка при экстрагенитальной гонорее (миндалин, глотки, прямой кишки). К одному из вариантов МПА, обогащенного для гонококка, добавляют антибиотики (полимиксина М сульфата — 20 ЕД/мл и линкомицина гидрохлорида — 2,0 мкг/мл). Готовую селективную среду разливают в чашки Петри. Среды с антибиотиками используют обязательно одновременно со средой без антибиотиков (одним из обогащенных вариантов МПА).

з) Среда Тейера-Мартина для выращивания N. gonorrhoeae из клинического материала (сухая), HiMedia, Thayer Martin Medium Base. Основу среды Тейера-Мартина с добавками используют для выделения N. gonorrhoeae из клинического материала.

Состав, г/л:
Пептон специальный — 23,0
Крахмал — 1,01
Натрия хлорид — 5,0
Агар — 1,0
pH 7,2±0,2

1. Сухую основную среду в количестве 21,0 г суспензируют в 250,0 мл дистиллированной воды. Среду кипятят до полного растворения.

2. Одновременно с основной средой готовят раствор гемоглобина. Haemoglobin Powder, Soluble (HiMedia, ED 022) представляет собой специально приготовленный порошок гемоглобина, сохраняющего активность после стерилизации. Для этого в 5,0 г порошка гемоглобина при постоянном помешивании медленно вливают 250,0 мл дистиллированной воды для получения однородной массы 2%-ного раствора гемоглобина.

Основу среды и раствор гемоглобина стерилизуют раздельно при 121°С в течение 15 мин. Затем оба компонента охлаждают до 45-50°С и соединяют, соблюдая правила асептики.

Для улучшения ростовых свойств среды приготовленную смесь обогащают витаминно-ростовой добавкой «Vitamino Growth Supplement» (HiMedia, FD 025), состоящей из двух частей:

Состав, мг:
1. Состав FD 025 на флакон (на 500,0 мл среды)
Витамин В12 — 0,1
L-глутамин — 100,0
Аденин SO₄ — 10,0
Гуанин HCl — 0,3
Р-аминобензойная кислота — 0,13
L-цистин — 11,0
НАД (кофермент) — 2,5
Кокарбоксилаза — 1,0
Железа нитрат — 0,2
Тиамин HCl — 0,03
Цистеин HCl — 259,0
Декстроза — 1,0

2. Жидкость для регидратации (на 500,0 мл среды):
Декстроза — 1,0
Вода дистиллированная — 10,0

Растворяют содержимое части 1 в 10,0 мл жидкости для регидратации, стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. После стерилизации раствор остужают до 50°С и добавляют к среде Тейера- Мартина.

Для выделения N. gonorrhoeae из урогенитального тракта, где, кроме него, присутствует обычно множество других бактерий и грибов, в среду для придания ей селективности вносят добавку VCN, состоящую из комплекса антибиотиков "VCN Supplement" (HiMedia).

Состав добавки VCN (на 500,0 мл среды):
Ванкомицин — 1,5 мг
Колистин метан сульфонат — 3,75 мг
Нистатин — 6250 ЕД

Комплекс перечисленных антибиотиков регидрируют в 10,0 мл дистиллированной воды и вливают в растопленную и охлажденную до 45-50°С среду при тщательном перемешивании, чтобы внесенные в нее антибиотики распределились равномерно. Дальнейшее повышение селективности среды может быть достигнуто внесением в нее триметоприма в дозе 2,5 мг на 500,0 мл среды.

и) Среды с углеводами для дифференциации гонококка и других нейссерий. Используется желточный МПА (вариант 4, но без сыворотки), содержащий 1% одного из углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, фруктоза, лактоза) и индикатор феноловый красный, в чашках Петри. Разложение углевода до кислот сопровождается пожелтением среды вокруг роста культуры.

Приготовление среды. К 100,0 мл расплавленного питательного агара для гонококка, охлажденного до 45-50°С, добавляют смесь, состоящую из 15,0 мл желтка, раствора 1,5 г одного из углеводов в 2,0 мл дистиллированной воды (этот раствор простерилизован в кипящей водяной бане 15 мин) и 6,0 мл 0,2%-ного водного раствора водорастворимого фенолового красного.

Приготовление раствора индикатора. 2,0 г водорастворимого фенолового красного разводят в 1000,0 мл дистиллированной воды, доводят pH до 7,8 (при помощи 20%-ного раствора гидроксида натрия — NaOH). Раствор стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин.

После перемешивания среды разливают в 5 чашек Петри (по числу углеводов). Засеянные испытуемыми культурами среды инкубируют при 37°С в эксикаторе с влажной ватой, но без свечи, в течение 1-2 сут.

При небольшом количестве испытуемых культур используют тот же желточный агар без сыворотки в одной чашке Петри. Чашку делят на 5 секторов (по числу углеводов). На каждый сектор пипеткой наносят по 1 капле стерильного 80%-ного раствора одного из углеводов в 0,2% растворе фенолового красного. Смесь углевода и индикатора предварительно стерилизуют в кипящей водяной бане 15 мин. После диффузии растворов углеводов в агар сектора засевают штрихами испытуемой культуры.

Посевы на средах с углеводами инкубируют без CO₂!

к) Среда для определения чувствительности гонококка к антибиотикам. К расплавленному и охлажденному до 50°С питательному агару для гонококка (GC-агар) добавляют 1% (по объему) комплексной питательной добавки (взамен нестандартных биодобавок).

Состав комплексной питательной биодобавки (КПД):
Глюкоза — 100,0 г
L-цистеин-гидрохлорид* — 25,0 г
L-глютамин — 10,0 г
L-цистин — 1,1 г
Никотинамид-адениндинуклеотид (НАД) — 0,25 г
Витамин В12 — 0,1 г
Тиамина пирофосфат — 0,1 г
Гуанина гидрохлорид — 0,03 г
Железа нитрат [Fe(NO₃)₃*6H₂O] — 0,02 г
Парааминобензойная кислота — 0,013 г
Тиамина гидрохлорид — 3,0 г
Дистиллированная вода — 1000,0 мл

* При определении чувствительности к карбапенемам и клавулоновой кислоте цистеин-гидрохлорид не применять!

Растворить ингредиенты в небольшом количестве воды и довести объем до 1,0 л. Стерилизовать фильтрацией через фильтр 0,02 мкм «Millex-LG» (Millipore).

Готовую питательную среду после добавления 1% раствора КПД, как и самое КПД, нельзя автоклавировать.

При разливе в чашки Петри, после застывания агара, чашки оставляют при комнатной температуре на 10-12 ч. Чашки с готовой средой можно хранить в герметичных пластиковых пакетах при +4°С не более 2 нед.

Некоторые штаммы гонококка плохо растут на среде без гемоглобина. В таких случаях их необходимо 2-3 раза пассировать на данной среде перед определением чувствительности.

л) Создание повышенной концентрации CO₂ в атмосфере (при культивировании патогенных нейссерий, пневмококка, гемофильных бактерий). Используют метод «свечного сосуда». Засеянные чашки Петри и пробирки помещают в эксикатор на сетку или стеклянную подставку (чашки вверх дном). На подставке укрепляют зажженную свечу длиной 2,0-3,0 см. Сосуд закрывают притертой крышкой. К моменту угасания свечи в сосуде создается необходимая для культивирования бактерий концентрация CO₂ — около 7,0-10,0%. Сосуд с посевами помещают в термостат. При большом количестве посуды с посевами (например, при обследовании коллективов на менингококковое носительство) инкубацию в термостате проводят в обычной атмосфере или в специальном термостате с подачей CO₂.

- Читать далее "Среды для выделения, культивирования и идентификации менингококка"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 27.2.2020