Для выделения и культивирования С. diphtheriae используют среды на высокопитательных основах, богатых аминокислотами, — переварах белка (мяса, рыбы, казеина, сои и др.). Сухие промышленные питательные агары и бульоны должны проверяться на пригодность в качестве основ сред для выращивания С. diphtheriae. При невозможности использования промышленных сухих питательных основ для коринебактерий применяют среды на триптическом переваре мяса по Хоттингеру. В качестве основы можно использовать агар на препарате «Аминопептид для микробиологических целей», разведенный 1:4, с добавлением 5% экстракта кормовых дрожжей. Содержание аминного азота в готовых основах — до 1,5 г/л; pH 7,5-7,6.

Для первичного посева материала с целью выделения дифтерийных бактерий используют агаровые среды, содержащие гемолизированную кровь (барана, лошади, кролика, морской свинки, донора) и 0,03-0,04% теллурита калия, подавляющего рост сопутствующей флоры.

Коринебактерии дифтерии восстанавливают металлический теллур из его солей, что способствует окрашиванию их колоний в черный цвет. Наиболее распространенные среды: кровяной теллуритовый агар и один из его вариантов — среда Клауберга-2.

а) Теллуритовая среда для транспортировки и обогащения проб на С. diphtheriae. Среда, применяемая при невозможности доставки материала в течение 3 ч.

Состав:
Полужидкий (0,1%) агар на питательном бульоне, соответствующем требованиям С. diphtheriae
Нормальная сыворотка лошади или крупного рогатого скота — 10%
Теллурит калия K₂TeO₃ — 0,02%

Полужидкий агар разливают в пробирки по 4,5 мл, стерилизуют при 112°С 15 мин и хранят в холодильнике (не более 2 нед.).

Непосредственно перед выездом за материалом в каждую пробирку стерильно добавляют по 0,5 мл нормальной сыворотки и по 0,05 мл (1 капле) 2%-ного раствора теллурита калия (см. рецепт «Кровяной теллуритовый агар»).

Цвет готовой среды бледно-желтый, среда опалесцирует.

Тампоны с материалом из зева и носа сразу после взятия погружают в транспортную среду; по доставке в лабораторию пробирки помещают в термостат для обогащения (подращивания). На другой день тампоном, слегка отжатым о стенки пробирки, делают посевы на один из вариантов кровяного теллуритового агара.

б) Кровяной геллуритовый агар.

Состав:
Агар питательный — 100,0 мл
Кровь дефибринированная гемолизированная — 10,0 мл
Теллурит калия K₂TeO₃ — 0,03-0,04 г

К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару добавляют 10% дефибринированной гемолизированной крови. Гемолиз достигается путем дву- или трехкратного попеременного замораживания и оттаивания. Можно достичь гемолиза эритроцитов при помощи дистиллированной воды. Для этого дефибринированную кровь отстаивают, удаляют надосадочную жидкость (плазму); к эритроцитарной массе добавляют дистиллированную воду в объеме, равном объему осадка.

Донорская кровь непосредственно из ампулы непригодна, так как содержит различные консервирующие добавки. При необходимости могут быть использованы эритроциты из ампулы для переливания крови после трехкратного отмывания изотоническим (0,85%) раствором натрия хлорида и подвергнутые гемолизу при помощи дистиллированной воды или замораживания/оттаивания.

К смеси агара и крови добавляют теллурит калия в конечной концентрации 0,03-0,04%, используя заранее заготовленный рабочий раствор (2%) теллурита калия. Его готовят путем растворения навески в дистиллированной воде на кипящей водяной бане 30 мин. 2%-ный раствор сохраняют в холодильнике не более 1 мес. Перед употреблением в случае образования в растворе осадка его снова прогревают на водяной бане до исчезновения хлопьев. К кровяному агару добавляют 1,5-2% (по объему) 2%-ного рабочего раствора теллурита.

После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри и используют для первичного посева материала из зева и носа, а также для высева из транспортной среды. Цвет готовой среды вишнево-красный. Чашки с готовым кровяным теллуритовым агаром можно хранить в холодильнике не более 7 сут.

в) Среда Клауберга-2. По составу соответствует 14%-ному кровяному теллуритовому агару с добавлением 1,8% глицерина. Учитывая значительное разбавление агаровой основы жидкими ингредиентами, для приготовления этой среды питательную основу готовят на 3%-ном агаре; в случае применения «Аминопептида» его разводят в соотношении 1:3. Если основу готовят на сухом питательном агаре, то количество навески, указанное на этикетке, увеличивают в 1,5 раза.

Основные ингредиенты среды Клауберга-2 (из расчета на 100,0 мл питательной агаровой основы):

Глицериновая смесь. К 40,0 мл дефибринированной крови добавляют 20,0 мл химически чистого глицерина, стерилизованного при 110°С 30 мин

Лаковая кровь. К 34,0 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16,0 мл дефибринированной крови

2%-ный раствор теллурита калия K₂TeO₃(приготовление — см. рецепт «Кровяной теллуритовый агар»),

К 100,0 мл питательной агаровой основы, расплавленной и остуженной до 45°С, добавляют 2,0 мл прокипяченного 2%-ного раствора теллурита калия, 10,0 мл глицериновой смеси и 50,0 мл лаковой крови, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

г) Цистин-теллурит-сывороточный агар (среда Тинсдейла, модифицированная).

Состав:
1-%-ный раствор цистина на 0,1N растворе серной кислоты H₂SO₄ — 12,0 мл
0,1 N раствор натрия гидроксида NaOH — 12,0 мл
2%-ный раствор теллурита калия K₂TeO₃ — 1,8 мл
2,5%-ный раствор натрия тиосульфата Na₂S₂O₃ • 5Н₂О — 1,8 мл
Питательный агар для дифтерийных бактерий, pH -7,6 — 100,0 мл
Нормальная лошадиная сыворотка — 20,0 мл

Цистин плохо растворим в воде, поэтому его вносят в среду в виде 1%-ного раствора в 0,1N растворе серной кислоты. Для нейтрализации этой кислоты в среду тут же вносят равное количество 0,1N раствора щелочи. Растворы щелочи и кислоты должны быть взаимно оттитрованы. Для работы можно использовать стандартные препараты фиксаналов. Приготовление и стерилизация раствора теллурита калия см. в прописи «Кровяной теллуритовый агар». Растворы теллурита и цистина можно приготовить впрок и хранить в холодильнике в темном сосуде. Раствор гипосульфита нестоек и не выдерживает стерилизации. Его готовят ex tempore на стерильной дистиллированной воде.

К расплавленному и остуженному до 45°С питательному агару, pH-7,6-7,8, асепетически добавляют ингредиенты в следующей последовательности: раствор цистина, щелочь, раствор теллурита, раствор тиосульфата, нормальная сыворотка. После внесения каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Незастывшую среду разливают в чашки Петри. Среда должна быть полупрозрачна, кремовожелтого цвета.

С. diphtheriae через 24-48 часов инкубации вырастает в виде мелких (1 мм) черных блестящих колоний, окруженных черно-коричневым ореолом (за счет образования сероводорода). Среда применяется для посева материала только от лиц с подозрением на заболевание дифтерией. Для выявления бактерионосителей среда непригодна по причине ее низких ростовых качеств.

д) Свернутая сыворотка Лёффлера как элективная среда для ускоренной диагностики дифтерии. Берется стерильная нативная сыворотка лошади или крупного рогатого скота, консервированная хлороформом или без консерванта. К 3-м частям сыворотки асептично добавляют 1 часть стерильного 1%-ного раствора глюкозы. Смесь асептически разливают в стерильные пробирки по 3,0 мл. Пробирки укладывают рядами на дно аппарата для свертывания, в косом положении. К моменту закладки пробирок аппарат должен быть нагрет до 50°С. Далее температуру постепенно доводят до 80°С (не допускать образования хлопьев и пузырей!). При этом режиме среду выдерживают в течение 1 часа, охлаждают при комнатной температуре и сохраняют при 6±4°С не дольше 2-х недель. В пробирках со свернутой сывороткой обязательно должна быть конденсационная вода внизу «косячка».

Среду используют для посева материала от больного с подозрением на заболевание дифтерией. Для этого ватный тампон, содержащий исследуемый материал (пленки, слизь из зева, носа, с поверхгости некротических участков и т.д.) вначале окунают концом в конденсационную воду, затем втирают в поверхность свернутой сыворотки. Через 6 часов инкубации дифтерийные бактерии вырастают в виде мелких точечных выпуклых колоний практически в чистой культуре, а сопутствующая флора еще не заметна. Из колоний готовят препараты-мазки, окрашенные синью Лёффлера. Среда может использоваться и для выращивания чистых культур С. diphtheriae.

е) Сывороточный агар (среда для культивирования чистых культур С. diphtheriae). К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару добавляют 10% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота (стерильной или с консервантом — хлороформом). Среду разливают в пробирки по 2,5-3,0 мл и дают застыть в скошенном состоянии. Цвет готовой среды бледно-желтый (сходен с цветом исходной агаровой основы). Пробирки со скошенным сывороточным агаром могут храниться в холодильнике не более 6 дней.

ж) Реактивы и постановка теста на уреазу но методу Заксе. Готовят два раствора: раствор мочевины в спирте (реактив А) и водный забуференный раствор индикатора фенолового красного (реактив И).

Реактив А. Мочевина — 2,0 г
Этиловый спирт 96° — 2,0 мл
Вода дистиллированная — 4,0 мл
Реактив не стерилизуют, хранят в холодильнике.

Реактив В. 0,2%-ный раствор фенолового красного — 1,0 мл
Калия фосфат однозамещенный (KH₂PO₄) — 0,1 г
Калия фосфат двузамещенный (K₂HPO₄ • H₂O) — 0,1 г
Натрия хлорид — 0,5 г
Вода дистиллированная — 99,0 мл

Реактив стерилизуют однократно текучим паром 15 мин, хранят в холодильнике.

В стерильную пробирку вносят ex tempore 19 частей раствора В и 1 часть раствора А, смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл, по числу испытуемых культур. В каждую пробирку вносят по нескольку петель испытуемой культуры (до помутнения жидкости). Пробирки помещают в термостат на 30 мин. При положительной реакции (наличии уреазы) смесь в пробирке приобретает красный цвет.

з) Среда Пизу (для определения цистиназы у коринебактерий). При невозможности использовать сухую коммерческую среду Пизу ее можно приготовить в лаборатории самостоятельно. В качестве основы берут 1,5%-ный питательный агар, приготовленный для С. diphtheriae на бульоне Мартена, среде ЛГВ, гидролизате казеина, рыбной муке или сухой агар для определения токсигенности. Реакция агаровой основы pH 7,6.

Состав:
1,5%-ный агар на бульоне Мартена или другой питательной основе, пригодной для дифтерийных бактерий, pH 7,6;
1%-ный раствор L-цистина в 0,1 N растворе H₂SO₄ или НС1;
0,1 N раствор NaOH;
10%-ный раствор ацетата свинца, свежеприготовленный и стерилизованный дважды текучим паром;
нормальная лошадиная или бычья сыворотка.

К 90,0 мл расплавленной (при 90°С) или свежесваренной питательной агаровой основы добавляют 2,0 мл 1%-ного раствора L-цистина в кислоте. Смесь перемешивают и добавляют к ней 2,0 мл 0,1 N раствора NaOH. После определения и подправления pH до 7,6 среду стерилизуют при 112°С в течение 30 мин и хранят в холодильнике. При необходимости агаровую среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и стерильно добавляют к ней 1,0 мл 10%-ного раствора ацетата свинца; смесь тщательно перемешивают, добавляют к ней 9,0 мл нормальной сыворотки и разливают в стерильные агглютинационные пробирки по 2,0-3,0 мл. Хранят в холодильнике.

В качестве 0,1 N растворов кислоты и щелочи можно использовать соответствующие фиксаналы.

Среда непрозрачна, имеет желтоватый цвет (цвет питательного агара).

Посев испытуемой культуры производят уколом. Через 20-22 ч по уколу и вокруг него на расстоянии 1,0 см от поверхности образуется темно-коричневое облачко ацетата свинца, окутывающее зону роста и свидетельствующее о расщеплении цистина. При отсутствии цистиназы потемнения среды не наблюдается.

и) Среда для определения токсигенности С. diphtheriae. В качестве основы используют пептон Мартена — продукт самопереваривания свиных желудков, смешанный с равным объемом мясной воды двойной концентрации (1 кг мясного фарша и 1000,0 мл воды), уплотненный агаром 1,5%. Для приготовления этой среды используют агары светлых сортов, обеспечивающих прозрачность. Среду категорически запрещается готовить в железной посуде (или в эмалированной посуде с выщербленной эмалью).

Состав:
Пептон Мартена — 500,0 мл
Мясная вода двойной концентрации — 500,0 мл
Агар — 15,0 г
Натрий уксуснокислый — 5,0 г
Мальтоза — 3,0 г
Нормальная сыворотка лошади — 20,0%
или крупного рогатого скота — 30,0%
pH 7,8-8,0

Навеску агара промывают в проточной воде в течение рабочего дня.

Смешивают пептон и мясную воду, в полученную смесь вносят отмытый и отжатый агар. Устанавливают pH 7,8-8,0 путем подщелачивания 20%-ным раствором натрия гидроксида (NaOH) по индикаторной бумажке с крезоловым красным (см. ниже), которая при такой реакции среды изменяет желтый цвет на малиново-розовый. Бульон кипятят в течение 10 мин, считая с момента закипания, после чего добавляют уксуснокислый натрий и мальтозу, проверяют и подправляют pH, кипятят 15 мин, дают отстояться в теплом помещении 2-3 ч и фильтруют через тканевый или ватно-марлевый фильтр. Разливают в стерильные пробирки (по 10,0 мл) или во флаконы и стерилизуют однократно текучим паром 30 мин.

Можно использовать специальную коммерческую среду, приготовленную по «Наставлению». Готовые агаровые среды хранят в холодильнике не более 1 мес.

Перед употреблением в расплавленную и остуженную до 45°С среду вносят нормальную сыворотку, после чего смесь наливают в чашку Петри тонким слоем (3,0 мм). На застывшую поверхность среды обожженным пинцетом накладывают по диаметру чашки стерильную полоску фильтровальной бумаги (размером 1,5x0,8 см), только что пропитанную 0,25 мл лечебной антитоксической противодифтерийной сыворотки (см. ниже) или коммерческим препаратом «Антитоксин диагностический сухой очищенный». Среда в чашке должна быть прозрачной и бесцветной или слегка желтоватой.

После 30-минутного подсушивания чашки засевают вдоль полоски с антитоксином испытуемыми колониями, снятыми непосредственно с кровяного теллуритового агара; каждую колонию засевают в виде отдельной бляшки.

Приготовление бумажек с крезоловым красным 0,1 г крезолового красного растворяют в 100,0 мл 95%-ного спирта и оставляют при температуре 37°С на 24 ч, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальной бумаги и быстро высушивают. Ярко-желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.

к) Приготовление раствора антитоксической сыворотки. Берут ампулу лечебной антитоксической противодифтерийной сыворотки (10 000 МЕ/мл), содержимое переносят в стерильную пробирку, куда добавляют стерильный изотонический (0,5%) раствор натрия хлорида до общего объема 10,0 мл. Полученный рабочий раствор, содержащий 1000 ME в 1,0 мл, хранят в холодильнике (не более 1 мес.). Перед постановкой теста на токсигенность из рабочего раствора стерильно отбирают объем, необходимый для приготовления нужного числа чашек. Отобранный объем разводят в 2 раза до конечной концентрации 500 МЕ/мл. Так, для приготовления двух чашек берут 0,25 мл исходного рабочего раствора, содержащего 1000 МЕ/мл, а для 5 чашек — 0,625 мл и т.д„ после чего рабочий раствор разводят вдвое (т.е. до 500 МЕ/мл).

Лежащие в пустой стерильной чашке стерильные полоски фильтровальной бумаги пропитывают полученным раствором антитоксина (500 МЕ/мл) — по 0,25 мл на каждую полоску (т.е. по 125 ME). Обожженным пинцетом полоски накладывают на агаровую среду по диаметру чашки Петри.

- Вернуться в оглавление раздела "Медицинская микробиология"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020