а) Среда Кларка для теста с метиловым красным (MR) и реакции Фогеса-Проскауэра (VP).

Состав:
Пептон — 0,5 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный (K₂HPO₄*3H₂O) — 0,5 г
Глюкоза — 0,5 г
Вода дистиллированная — 100 мл
pH 6,0± 0,1

Перечисленные ингредиенты размешивают в 1000,0 мл дистиллированной воды, кипятят в течение 2-3 мин. Фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH гидроксидом натрия. Разливают по 3-5 мл в пробирки и стерилизуют 3 дня текучим паром в течение 20 мин или при 112°С в течение 20 мин.

Бульон используется для постановки теста с метиловым красным и реакции Фогес-Проскауэра (VP).

Тест с метиловым красным (MR) позволяет по конечной pH (<5,0 или >5,8) определить, по какому пути пойдет разложение пировиноградной кислоты, образующейся при ферментации глюкозы у бактерий: по пути образования смеси органических кислот или по бутиленгликолевому пути с образованием нейтральных продуктов ацетоинаи бутанодиола.

б) Реактив к реакции с метиловым красным.

Состав:
Метиловый красный — 0,1 г
Спирт этиловый — 300,0 мл
Вода дистиллированная — 200,0 мл

Краску растворяют в спирте, затем добавляют воду. Для постановки теста реагент добавляют в количестве 5-6 капель.

При накоплении кислот (рН<5,0) индикатор метиленовый красный окрашивает среду Кларка в красный цвет, при образовании ацетоина и бутанодиола (рН>6,0) — в желтый.

Реакцию Фогес-Проскауэра (VP) ставят для выявления ацетоина (ацетил-метил-карбинола), одного из продуктов метаболизма пировиноградной кислоты, образующейся при ферментации глюкозы.

К 2,5 мл 48-часовой испытуемой культуры на среде Кларка добавляют 0,3 мл раствора альфа-нафтола и 0,1 мл раствора гидроокиси калия (КОН), осторожно встряхивают пробирку и оставляют ее при комнатной температуре на 10-15 мин (не дольше!), после чего учитывают результат. Покраснение среды расценивается как положительная реакция VP.

в) Реактивы к реакции Фогес-Проскауэра:
Реактив 1. Навеску а-нафтола (5,0 г) растворяют в 100,0 мл 96° этилового спирта.
Реактив 2. Навеску КОН (40,0) г растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды. Примечание. Раствор α-нафтола хранится при 4°С не более 1 года.

г) Среда для теста на гидролиз эскулина. Эту среду используют для диагностики стрептококков и других микроорганизмов.

Состав:
Эскулин — 1,0 г
Пептон — 10,0 г
Экстракт мясной — 10,0 г
Натрия хлорид NaCl — 5,0 г
Железа (III) цитрат — 0,5 г
pH 7,1 ±0,1

Ингредиенты смешивают, растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды при подогреве. Устанавливают pH до 7,1±0,1. Разливают по 3,0-5,0 мл в пробирки. Стерилизуют при 112°С в течение 30 мин. Готовая среда имеет светло-коричневый цвет.

Образующийся при гидролизе эскулина эскулетин связывается с ионами железа и образует соединение черного цвета, окрашивающее среду.

д) Агар Кристенсена с мочевиной. Агар (и бульон) Кристенсена с мочевиной используют для выявления у бактерий фермента уреазы, расщепляющей мочевину до углекислоты и аммиака; последний вызывает повышение щелочности среды.

Состав:
Пептон —1,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Глюкоза — 1,0 г
Калия фосфат однозамещенный (KH₂PO₄) — 2,0 г
Мочевина — 20,0 г
Феноловый красный — 0,012 г
Агар —15,0 г
Дистиллированная вода — 1000,0 мл

Готовят 20%-ный раствор мочевины в 100,0 мл воды, куда добавочно вносят хлорид натрия, однозамечценный фосфат калия, 6 мл раствора фенолового красного 1:500, устанавливают pH 6,8-6,9. Раствор стерилизуют фильтрованием и добавляют его к 900 мл стерильного расплавленного и остуженного до 50-55°С агара. После перемешивания среду разливают в пробирки по 4-5 мл и скашивают.

е) Нитратный агар Симмонса. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий и других неприхотливых микроорганизмов на основании способности утилизировать цитрат.

Состав:
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Магний сернокислый (MgSO₄*7H₂O) — 0,2 г
Фосфорно-кислый аммоний однозамещенный (NH₄H₂PO₄) — 1,0 г
Натрия цитрат кристаллический — 2,77 г
Агар — 20,0 г
1,5%-ный спиртовой раствор бромтимолового синего — 10,0 мл
Калия фосфат двузамещенный (К₂НРО₄) — 1,0 г
Вода — 1000,0 мл
pH 7,2±0,1

Навеску сухих ингредиентов растворяют в 1000,0 мл воды, доводят до расплавления агара путем нагревания. Устанавливают pH 7,2. Добавляют 10 мл спиртового раствора бромтимолового синего. Фильтруют через вату, разливают в пробирки по 4,0-5,0 мл, автоклавируют при 121°С 15 мин и скашивают. Цвет среды — оливковый.

При положительном результате цвет среды меняется на синий за счет появления щелочного карбоната Na₂CO₃ из цитрата как единственного источника углерода. При отрицательном результате рост многих видов отсутствует.

ж) Среда и реагент на гидролиз гиппурата. Для теста на гидролиз гиппурата может быть использован любой коммерческий питательный бульон (аминный азот — 1,3-1,4 г/л) с добавлением 1% гиппурата натрия, а также специальная коммерческая сухая среда (например, Hippurate Hydrolysis Broth, HiMedia).

Реагент. В 100 мл раствора, содержащего 5,4 мл 37%-ного раствора соляной кислоты (HCl) и 94,6 мл дистиллированной воды, вносят 12,0 хлорида железа (FeCl₃> • 6Н₂О).

Постановка теста. К 0,8 мл надосадочной жидкости бульонной культуры испытуемого штамма добавляют 0,2 мл реагента. В случае ферментации гиппурата выпадает нерастворимый осадок желто-коричневого цвета.

з) Среды с аминокислотами (для определения лизин- и орнитиндекарбоксилазы и аргининдегидролазы). Среды предназначены для дифференциации энтеробактерий и других микроорганизмов.

Состав, г/л:
Пептон — 5,0
Глюкоза — 1,0
Бромтимоловый (бромкрезоловый) синий — 0,03
L — аминокислота (лизин или орнитин, или аргинин) — 10,0 или DL-аминокислота — 20,0
pH 6,5±0,5

Ингредиенты среды вносят в 1000,0 мл дистиллированной воды, нагревают до растворения, при необходимости фильтруют. Устанавливают необходимую pH. Разливают в бактериологические пробирки по 2,5-3,0 мл. Стерилизуют при 11 ()°С 30 мин. Контрольная среда не содержит аминокислоту. Готовая среда имеет желтовато-зеленый цвет, при разложении субстрата среда синеет. Контрольная (незасеянная) среда становится желтой.

и) Агар с фенилаланином и реактив для определения дезаминазы. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий и других микроорганизмов.

Состав:
Дрожжевой экстракт сухой — 3,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Натрия гидрофосфат (Na₂HPO₄*12H₂O) — 1,0 г
L-фенилаланин — 1,0 г
или DL-фенилаланин — 2,0
Агар — 12,0
pH 7,1 ±0,1

Ингредиенты среды вносят в 1000,0 мл дистиллированной воды, растворяют при нагревании, при необходимости фильтруют. Разливают в бактериологические пробирки по 3,0-4,0 мл. Стерилизацию проводят при 112°С в течение 30 мин, затем среду скашивают. Готовая среда не окрашена.

к) Реактив для определения фенилаланин-дезаминазы.

Состав:
Железа (III) хлорид (FeCl₂*6H₂O) — 10,0 г
Вода дистиллированная — 100,0 мл
Хранение реактива — при температуре 6±4°С в темноте.

Постановка реакции. На выросшую суточную культуру на агаре с фенилаланином наносят 0,5 мл хлорида железа; при положительной реакции среда приобретает зеленый цвет.

л) Среда для определения индолообразования. Предназначена для выращивания энтеробактерий и других микроорганизмов с целью определения продукции индола. Готовят ее из бульона на основе триптического перевара казеина или на основе бульона Хоттингера, к которому добавляют 0,3% триптофана. pH 6,8±0,1. Среду разливают в пробирки по 0,5 мл. Готовая среда имеет цвет бульона.

Образование индола можно выявлять при помощи индикаторных бумажек (по Морелю или Джиллису) или с применением специальных реактивов.

м) Реактивы на индол:

1. Реактив Эрлиха:
Пара-диметиламинобензальдегид — 1,0 г
Спирт этиловый 96° — 95,0 мл
Кислота хлористоводородная концентрированная — 20,0 мл

2. Реактив Ковача:
Пара-диметиламинобензальдегид — 5,0 г
Спирт изоамиловый — 75,0 мл

Кислота хлористоводородная концентрированная — 25,0 мл Пара-диметиламинобензальдегид растворяют в спирте, добавляют кислоту. Оба реактива имеют желтый цвет, хранятся при температуре 6(±4)°С.

На поверхность суточной бульонной культуры осторожно наслаивают один из реактивов, осторожно встряхивают. При положительном результате образуется красное кольцо на границе реактива и бульона.

н) Питательный желатин (для определения желатиназы). Среда предназначена для определения протеолитической активности микроорганизмов.

Состав:
Бульон Хоттингера — 1000,0 мл
Желатин пищевой высшего сорта — 100,0 г
pH 7,1±0,1

Желатин вносят в бульон для набухания на 1,5-2 ч, нагревают в водяной бане при 40-50°С до полного растворения. Устанавливают pH. При необходимости среду фильтруют или осветляют при помощи суспензии куриных яиц (2 яйца, размешанных в двойном объеме холодной воды, вносят в среду, нагревают до свертывания белка, затем снова фильтруют). Разливают в пробирки по 8,0-9,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин. Готовая среда имеет желтовато-коричневый цвет. Испытуемую культуру сеют уколом. Для учета разжижжения желатина пробирки с выросшими культурами выдерживают при +4°С.

о) Молочный агар Эйкмана (для теста на пептонизацию казеина).

Состав:
Пептон - 10-20,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Глюкоза — 10,0 г
Снятое молоко — 300,0 мл
Агар — 10,0 г
pH 7,4±0,2

Пептон, хлорид натрия и агар растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, смесь нагревают до кипения, горячий раствор фильтруют через ватно-марлевый или полотняный фильтр, добавляют 10,0 г глюкозы, устанавливают pH. Стерилизуют при 121°С в течение 20 мин. К 1000,0 мл стерильной, расплавленной на водяной бане и охлажденной среде добавляют, соблюдая правила асептики, 300,0 мл стерильного снятого молока, хорошо перемешивают.

Среду используют без дополнительной стерилизации, так как совместная стерилизация молока с агаром неприменима из-за свертывания казеина и образования хлопьев.

Испытуемую культуру сеют с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. В случае пептонизации молока вокруг колоний формируются прозрачные ореолы (зоны просветленной среды).

п) Бульон с куриным яичным белком (для теста на протеолиз куриного белка). В пробирки со стерильным бульоном Хоттингера нейтральной реакции добавляют кусочки вареного куриного белка, нарезанные в форме кубиков с гранями 5,0-8,0 мм. Белок куриного яйца нарезают в стерильной посуде, а затем стерилизуют в течение 20 мин при температуре 121°С. Стерильные кубики коагулированного белка добавляют к стерильному бульону, соблюдая асептические условия.

Пробирки засевают испытуемыми культурами и инкубируют 1-5 дней при 37°С. При положительном результате кусочки коагулированного белка расщепляются до крошковидной массы на дне пробирки вплоть до полного лизиса белка.

р) Среда для выявления дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) у бактерий. Применяется для выявления ДНКазы у стафилококков, моракселл, серраций и др.

Готовят мясопептонный агар (МПА), содержащий разные концентрации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК): 0,05%, 0,1% и 2,0%. Для этого навески ДНК 0,05 г, 0,1 г и 2,0 г растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды, подщелоченной четырьмя-пятью каплями 2М раствора натрия гидроксида (NaOH). В емкости, содержащие по 100 мл расплавленного МПА, pH-8,6, добавляют растворенные навески ДНК, перемешивают и прогревают в кипящей водяной бане 20 мин. Среды хранят при +4°С. Для постановки теста среды расплавляют и перед разливкой в чашки Петри добавляют по 0,5 мл стерильного фармакопейного 10%-ного раствора кальция хлорида (CaCl₂). На подсушенную среду засевают штрихами или бляшками испытуемые 18-часовые культуры. Через 24 ч инкубации на поверхность среды с культурами наливают 5 мл 0,Ш раствора соляной кислоты (HCI) на 3-5 мин, после чего избыток кислоты отсасывают пипеткой.

При наличии ДНКазы вокруг роста культуры появляются зоны просветления за счет деполимеризации ДНК бактериальной ДНКазой. При положительном результате прозрачная доза должна в 4-5 раз быть шире штриха или колоний, которые она окружает. Степень активности ДНКазы оценивают при помощи сред, содержащих разные концентрации ДНК.

с) Среда для выявления щелочной фосфатазы у бактерий.

Состав:
Мясопептонный 1,8% агар (МПА, 32.2.1.1) — 100 мл
Натриевая соль дифосфат-фенолфталеина — 0,05 г pH 8,0±0,2

В расплавленный и остуженный до 45-50°С стерильный МПА асептически вносят 0,05 г дифосфат-фенолфталеина натрия, предварительно растворенного в 3 мл стерильной воды. Содержимое сосуда хорошо перемешивают, устанавливают pH, разливают в чашки Петри.

Испытуемые суточные культуры высевают на поверхность среды бляшками или штрихами. После инкубации в течение 18-24 ч вокруг посевов образуются светло-розовые зоны за счет образовавшегося свободного фенолфталеина. Реакция усиливается при помощи аммиака. Для этого на крышку чашки Петри наносят 5-6 капель 25%-ного раствора гидроокиси аммония (NH₄OH) и ставят ее под перевернутую (вверх дном!) чашку с выросшими испытуемыми культурами.

При положительной реакции розовый цвет индикатора преобразуется в малиновый с лиловым оттенком.

т) Среда для выявления кислой фосфатазы у бактерий.

Состав:
Мясопептонный 1,8% агар (МПА, 32.2.1.1) — 100 мл
р-нитрофенилфосфат — 0,01 г
pH 4,5-5,5

В расплавленный и остуженный до 45-50°С МПА добавляют 0,01 г р-нитрофенилфосфата, предварительно растворенного в 3 мл стерильной воды. Содержимое сосуда перемешивают, устанавливают pH, разливают в чашки Петри.

Испытуемые культуры засевают штрихами для получения изолированных колоний. Инкубируют 2-5 сут. при 37°С. При положительном результате кислая фосфатаза расщепляет р-нитрофенилфосфат с образованием свободного нитробензола желтого цвета. Вокруг колоний в этом случае формируются желтые ореолы.

у) Среда с кукурузным маслом для определения липазы:

Состав, г/л:
Пептон — 10,0
Экстракт дрожжевой — 3,0
Натрия хлорид — 5,0
Агар - 20,0
pH 7,7±0,1

Ингредиенты растворяют при нагревании в 900,0 мл дистиллированной воды. Устанавливают pH. Добавляют 100,0 мл водного раствора индикатора (Victoria blue 1:1500). Вносят в среду кукурузное масло до 5% (об.) и тщательно перемешивают с использованием магнитной мешалки или смесителя. Разливают в пробирки, стерилизуют при 112°С 30 мин. Для скашивания агара пробирки оставляют в наклонном положении. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет. Липолитическая активность определяется (через 24-48 ч) по радужному переливу агара вокруг колоний и на поверхности самих колоний.

ф) Лакмусовое молоко в прописи Минкевича. 100,0 мл свежего молока подщелачивают 10%-ным раствором питьевой соды до слабощелочной реакции (по лакмусу), кипятят и добавляют 100,0 мл дистиллированной воды и 5,0 мл лакмусовой настойки. Приготовленную таким образом среду сливают в бутыли, добавляют на 100,0 мл среды 1,0 мл хлороформа, плотно закрывают резиновой или корковой пробкой, хорошо встряхивают и ставят на 2-3 дня в темное место. Будучи тяжелее воды, хлороформ оседает на дно, увлекая за собой растворившиеся в нем сливки. Обезжиренную таким образом среду осторожно сливают, разливая в пробирки по 5,0 мл. Стерилизуют 20 мин при температуре 112°С.

Для приготовления лакмусовой настойки лакмус растирают в порошок и в течение 3 сут. экстрагируют в термостате при 37°С десятикратным объемом 96%-ного спирта. Спирт сливают, осадок высушивают, к нему доливают 10-кратное количество дистиллированной воды. Настаивают в течение 3 сут. при комнатной температуре и фильтруют. Полученную настойку хранят в темном месте.

Вынутая из автоклава среда вследствие редукции лакмуса имеет желтый цвет, а через несколько часов приобретает характерный для нее бледно-фиолетовый оттенок.

В результате роста различных видов бактерий лакмусовое молоко изменяется неодинаково. Изменение среды отмечают в протоколе исследования, пользуясь условными обозначениями:

N — рост бактерий, не сопровождающийся изменением реакции среды и, следовательно, изменением ее цвета;

К — кислотообразование в среде с четко выраженным порозовением ее;

NK — слабовыраженное кислотообразование, вызывающее изменение оттенка среды, улавливаемое только при сопоставлении опытной пробирки с контрольной (незасеянная среда);

Щ - щелочеобразование, сопровождающееся явно выраженным посинением среды;

МЩ — слабовыраженное щелочеобразование, сопровождающееся изменением оттенка среды, улавливаемое только при сопоставлении ее с цветом контрольной пробирки;

Р — реакция лакмуса, проявляющаяся полным обесцвечиванием последнего.

х) Среда Хью-Лейфсона для OF-теста (модифицированная). Предназначена для определения способа утилизации углеводов микроорганизмами по анаэробному или аэробному пути (ферментация, окисление или отсутствие утилизации).

Состав:
Пептон — 2,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Калия фосфат двузамещенный (KH₂PO₄*3H₂O) — 0,3 г
Глюкоза (в растворе) — 10,0 г
Бромтимололвый синий — 0,05 г
Агар — 2,0 г
pH 6,8±0,2

Ингредиенты (кроме глюкозы) растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды при нагревании. Устанавливают pH. При необходимости фильтруют. Стерилизуют при 112°С 15 мин. Отдельно готовят 100,0 мл 10%-ного раствора глюкозы, стерилизованного текучим паром 3 дня подряд. К 900,0 мл готовой стерильной среды асеп-тично добавляют 100,0 мл раствора глюкозы. Разливают в пробирки по 3,0-4,0 мл. Готовая среда имеет зеленовато-синий цвет. Глюкоза может быть заменена на другие углеводы. Для использования среды готовят стерильное вазелиновое масло. Для прихотливых микроорганизмов в среду добавляют 2% нормальной лошадиной сыворотки.

Испытуемую культуру засевают уколом в 2 пробирки со средой; содержимое одной из них запивают стерильным вазелиновым маслом слоем 1 см. Инкубируют при 37°С 72 ч (иногда дольше) до изменения цвета среды хотя бы в одной пробирке. При окислении углевода (О) в пробирке под маслом, без доступа кислорода, цвет среды остается зеленым, без масла — становится желтым. При ферментации (F) в пробирке под маслом и в пробирке без масла цвет становится желтым. В случае отсутствия разложения углевода в обеих пробирках сохраняется первоначальный сине-зеленый цвет.

ц) Среда для определения редукции нитратов (тест на нитратредуктазу). Предназначена для дифференциации энтеробактерий, нейссерий и других микроорганизмов.

Состав:
Пептон — 5,0 г
Калия нитрат (свободный от калия нитрита) (KNO₃) — 2,0 г
pH 7,2±0,1

Ингредиенты растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды. Устанавливают pH. Разливают в пробирки по 5,0 мл. В каждую пробирку помещают «поплавок» Дюрхема донышком вверх. Стерилизуют при 121°С 15 мин. Готовая среда имеет желтовато-коричневый цвет.

ч) Реактив для определения питратредуктазы (реактив Грисса).

Состав:
Раствор 1. Сульфаниловая кислота — 8,0 г
Уксусная кислота, 5N раствор (1 часть ледяной уксусной кислоты и 2,5 части дистиллированной воды) — 1000,0 мл
Раствор 2. α-нафтиламин — 5,0 г
Диметил α-нафтиламин — 6,0 г
Уксусная кислота (5 N раствор) — 1000,0 мл

Реактивы готовят при слабом нагревании с особой осторожностью из-за их токсичности. Хранение — при температуре 6±4°С в герметично укупоренных емкостях из темного стекла. Срок годности — 2-3 мес. Непосредственно перед постановкой теста оба раствора смешивают в равных объемах.

Для постановки реакции используют 7-10-дневную культуру на нитратном бульоне, ставя пробы ежедневно до получения положительного результата. К 0,5 мл культуры в агглютинационной пробирке добавляют по 1-2 капли смеси растворов №1 и №2. При положительной реакции наблюдается красное окрашивание. О наличии газа N₂ судят по его накоплению в поплавке Дюрхема.

- Читать далее "Среды для выделения и изучения стафилококков"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020