а) Питательные основы сред для выделения и культивирования пневмококка. Для выделения и культивирования пневмококка используют среды на высокопитательных основах с обязательным добавлением нормальной сыворотки или крови. В качестве основы применяют триптические перевары белка — мяса, бычьего сердца, сои, казеина, плаценты, кровяных сгустков с конечным содержанием 1,6-1,8 г/л аминного азота. Рекомендовано добавление к основам экстракта кормовых дрожжей (ЭКД).

Из питательных основ лабораторного изготовления чаще всего используют агар на триптическом переваре мяса по Хоттингеру. Специально для пневмококка разработан рецепт питательного агара ВНИИП.

Из коммерческих сухих питательных основ используют триптиказосоевый агар, и Сухой казеиново-дрожжевой агар для пневмококка (НПО «Питательные среды»).

б) Питательный агар ВНИИП. Из питательных основ лабораторного изготовления чаще всего используют агар на триптическом переваре мяса. Специально для пневмококков разработан рецепт питательного агара ВНИИП, основа которого содержит:

70-75% гидролизата мяса по Хоттингеру или казеина (1,8-2,0 г/л аминного азота);
20-25% гидролизата бычьих сердец (1,4-1,6 г/л аминного азота);
1,7-2,0% агара;
pH 7,6.

Стерилизация при 112°С 20 мин. Перед употреблением к расплавленной и остуженной до 45°С среде асептично добавляют 0,5% стерильного раствора ЭКД (вместе с сывороткой или кровью).

в) Кровяной агар, неселективный и селективный. К расплавленной и остуженной до 45°С питательной агаровой основе для пневмококка добавляют 5,0-7,0% свежей дефибринированной крови барана, лошади или кролика. Среду разливают в чашки Петри. Цвет готовой среды — ярко-красный; среда непрозрачна.

Для облегчения выделения пневмококка из полимикробного материала (мокрота — 1:10, бронхиальные смывы, отделяемое среднего уха, слизь из носоглотки) с целью подавления посторонней флоры на участок засеянного кровяного агара стерильным пинцетом накладывают стандартный диск с антибиотиками — мономицином или гентамицином. После инкубации в термостате через 22-24 ч вокруг диска вырастают преимущественно колонии пневмококка.

Можно приготовить селективный кровяной агар с гентамицином. К расплавленной и остуженной до 45°С питательной агаровой основе для пневмококка добавляют 5,0-7,0% дефибринированной крови и раствор гентамицина из расчета создания его конечной концентрации в среде 5 мкг/мл.

г) Сывороточный агар. Используется не только для посевов стерильных в норме жидкостей (СМЖ, плевральная, асцитическая, синовиальная и т.д.), но и является основной средой для культивирования и изучения выделенных чистых культур пневмококка. К расплавленному и остуженному до 45°С питательному агару для пневмококка добавляют 20% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота, стерильной или с консервантом хлороформом. Смесь перемешивают и разливают в чашки Петри или в пробирки по 3,0-3,5 мл для получения скошенного агара. Среда полупрозрачна, имеет кремово-желтоватый цвет.

Чашки с кровяным и сывороточным агарами можно сохранять в холодильнике не более 2 сут.; пробирки со скошенным сывороточным агаром — не более 5 сут.

д) Тесты для дифференциации пневмококка и сходных с ним α-гемолитических стрептококков и энтерококков:

1. Оптохиновый тест. Изучаемую культуру густо (газоном) засевают на участок кровяного агара размером не менее 4,0x4,0 см в чашке Петри. Стерильным пинцетом на середину посева накладывают коммерческий диск с оптохином. После инкубации в термостате в течение 18-22 ч рост пневмококка вокруг диска отсутствует. Величина диаметра зоны подавления роста должна быть не менее 18 мм (или другого размера, указанного в «Наставлении» к оптохиновым дискам). Рост α-гемолитических стрептококков и энтерококков оптохином не подавляется.

2. Желчный тест. Для постановки теста используют желчь крупного рогатого скота без консервантов (лучше взятую стерильно на бойне) или свежевзятую желчь кролика.

Метод диска. На 20-22-часовую испытуемую культуру, выросшую в результате густого посева газоном на кровяном агаре, накладывают стерильный диск фильтровальной бумаги (диаметром 1,0 см), свежепропитанный 20%-ным раствором желчи. Чашку снова помещают в термостат на 2-3 ч. По истечении этого времени вокруг диска наблюдается зона (1-2 мм) полного исчезновения колоний пневмококка; рост колоний других стрептококков и энтерококков не нарушается.

Желчный бульон. В пробирку с 3,0 мл мясопептонного бульона с 10% желчи добавляют 1,0 мл взвеси (или бульонной культуры) испытуемого штамма; смесь помещают в термостат на 1 ч. Для контроля эту же взвесь испытуемой культуры вносят в другую пробирку с бульоном, но без желчи. Если через 1 ч в опытной пробирке заметно просветление (по сравнению с контролем), то тест положителен, т.е. испытуемая культура чувствительна к желчи. При нечетко выраженном результате обе пробирки могут быть оставлены на одни сутки при комнатной температуре.

Желчь в бульоне может быть заменена дезоксихолатом натрия в конечной концентрации 10%.

3. Термическая проба. Взвесь суточной испытуемой 24-часовой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида прогревают в водяной бане при 60°С 30 мин. После остывания при комнатной температуре из прогретой взвеси делают высев на кровяной (или сывороточный) агар для пневмококка. Для контроля делают высев из непрогретой взвеси. Если через 1 сут. инкубации высев из прогретой взвеси оказался положительным, как и в контроле, то испытуемая культура не является пневмококком.

- Читать далее "Среды, тесты для выделения, культивирования и идентификации коринебактерий дифтерии"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020