а) Желточно-солевой агар. Среда предназначена для выделения стафилококков и выявления пигмента.

Для приготовления используют мясопептонный агар (pH 7,3±0,1) с добавлением 10% натрия хлорида. После розлива во флаконы по 100,0-200,0 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 121°С.

Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и добавляют 20% (по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Среду быстро перемешивают, разливают в чашки, которые продолжительное время могут оставаться в холодильнике в полиэтиленовых пакетах. Готовая среда полупрозрачна, имеет беловатый цвет с легким кремовым оттенком.

Учет результатов производят через 36-48 ч инкубации в термостате при 35-37°С. На этой среде хорошо выявляются пигментные свойства микроорганизма, обусловленные липохромным пигментом. Вокруг колоний можно видеть радужный венчик за счет образования лецитовителлазы. Добавление к среде 10% стерильного снятого молока усиливает пигментообразование.

б) Желточная среда по Г.Н.Чистовичу. Среда предназначена для определения лецитиназной активности стафилококков.

К мясопептонному питательному агару, приготовленному по общепринятой прописи, добавляют 20% желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида).

При определении лецитиназной активности по методу Чистовича исследуемую культуру стафилококка засевают на среду отдельными штрихами или бляшками. Посевы помещают в термостат при 36-37°С. Вокруг колоний стафилококка, продуцирующих лецигиназу, образуются четко выраженные зоны помутнения с радужным венчиком по периферии.

в) Среда Casman E.R. в модификации Ф.С.Флуера для получения стафилококкового энтеротоксина.

Состав:
Ферментативный гидролизат казеина
Цитрат железа — 0,25 г
KH₂PO₄ - 1,0 г
К₂HPO₄*3H₂O - 1,0 г
MgSO₄*7H₂O - 0,2 г
L-цистин — 0,025 г
L-триптофан — 0,075 г
Ацетат натрия — 7,0 г
Кальция пантетонат — 0,0005 г
Тиамин гидрохлорид — 0,00004 г
Никотиновая кислота — 0,0012 г
Дистиллированная вода — до 1000,0 мл

Навески ингредиентов (кроме четырех — см. ниже) вносят в колбу с ферментативным гидролизатом казеина; объем ферментативного гидролизата вносится из расчета конечного содержания аминного азота в среде — 2,0 г/л. Затем вносят L-триптофан, предварительно растворенный в 3 мл 1N раствора НО. Общий объем воды доводят до 1 л дистиллированной водой, тщательно перемешивают. Подогревают (при частом перемешивании) и кипятят 1 мин для полного растворения. Устанавливают pH среды 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 15 мин.

Кальций пантетонат, тиамин гидрохлорид и никотиновую кислоту стерилизуют отдельно через миллипоровские фильтры и добавляют асептически в среду перед посевом.

Подготовка раствора кальция пантегоната: берут навеску 500,0 мкг, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильного пангентоната кальция асептически перед посевом добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

Подготовка раствора тиамина гидрохлорида: берут навеску 40,0 мкг, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильного раствора тиамин гидрохлорида асептически добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

Подготовка раствора никотиновой кислоты: берут навеску 12,0 мкг никотиновой кислоты, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильной никотиновой кислоты асептически добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

г) Бульон для энтеротоксигенных стафилококков HiMedia, Casein Hydrolysate Broth. Бульон используют для культивирования стафилококков с целью получения энтеротоксина, используемого в пробе на котятах и в серологических исследованиях.

Состав, г/л:
Гидролизат казеина кислотный — 20,0
Железа цитрат — 0,025
Калия дигидроортофосфат — 2,0
Магния сульфат — 0,20
L-цистин — 0,025
Натрия ацетат — 7,0
L-триптофан — 0,075
Кальция пантотенат — 0,0005
Тиамин — 0,00004
Никотиновая кислота — 0,0012
pH 7,3±0,2

Навеску среды 29,33 г вносят в 1000,0 мл дистиллированной воды. Тщательно размешивают. Подогревают (при частом помешивании) и кипятят 1 мин для полного растворения. Устанавливают pH. Разливают в соответствующие емкости. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин.

Испытуемые на энтеротоксигенность стафилококки засевают на этот бульон, выращивают в течение 18-24 ч при 35°С в атмосфере, содержащей 30% углекислоты. Полученную культуру из каждой пробирки в количестве 3,0 мл засевают в два флакона со 100,0 мл той же среды и инкубируют в тех же условиях 3 дня. Бульонные культуры затем центрифугируют и надосадочную жидкость пропускают через мембранный фильтр для стерилизации.

Полученные фильтраты тестируют на присутствие α- и β-гемолизинов. В случае положительного результата токсин денатурируют прогреванием или нейтрализуют иммунной сывороткой. После денатурации фильтраты можно вводить котятам и наблюдать за появлением рвоты.

Этот бульон можно использовать для приготовления плотной среды, если добавить в его состав агар. Культуры, выращенные на таком агаре, можно применять и для заражения других животных, и для исследования в системе антиген-антитело методом диффузии.

Готовая среда янтарной окраски, прозрачна или опалесцирует.

д) Бульон для получения и очистки токсина синдрома токсического шока (ТСТШ).

Состав:
Бактопентон Difco — 6,0 г
Никотиновая кислота — 1,0 мг
Солянокислый тиамин — 5,0 мг

Бактопептон Difco растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды, устанавливают pH6,5 и проводят стерилизацию в течение 15 мин при 121°С. Никотиновую кислоту и солянокислый тиамин добавляют асептически в среду перед посевом. Предварительно берут 10,0 мг никотиновой кислоты, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл добавляют к 100,0 мл среды перед посевом.

Раствор солянокислого тиамина готовят следующим образом: берут 50,0 мг солянокислого тиамина, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, затем стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и асептически добавляют 1,0 мл к 100,0 мл основной среды.

е) Солевой бульон для обогащения материала, исследуемого на энтеротоксигенные стафилококки. К 100,0 мл мясопептонного бульона (МПБ) с pH 7,3 добавляют 6,5 г хлористого натрия и разливают в пробирки по 10,0 мл, стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 20 мин.

ж) Среда Фогель-Джонсона, плотная среда для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптиказа — 1,0 г
Дрожжевой экстракт — 0,5 г
Глицин — 1,0 г
Маннит — 1,0 г
Хлористый литий — 0,5 г
Двузамещенный фосфат катия K₂HPO₄*3H₂O — 0,5 г
Теллурит калия (1% раствор) — 2,0 мл
Феноловый красный — 0,0025 г
Агар — 1,6 г
Дистиллированная вода — 100,0 мл

Навески триптиказы, дрожжевого экстракта, глицина, маннита, хлористого лития, двузамещенного фосфата калия, фенолового красного и агара растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды.

Устанавливают pH 7,2 и стерилизуют в автоклаве при 121°С 20 мин. Теллурит калия добавляют асептически в остуженную среду до 45°С перед посевом. Среду разливают в чашки Петри.

з) Теллурит-полимиксин-желточный агар (г/100 мл) для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптон — 1,1 г
Дрожжевой экстракт — 0,55 г
Маннит — 0,55 г
Хлорид натрия NaCl — 2,2 г
Теллурит калия (1%-ный раствор) — 1,0 мл
Желток яйца (в 50 мл физиологического раствора) — 10,0 мл
Полимиксинсульфат (1%-ный раствор) — 0,04 мл
Агар — 2,0 г

Навески триптона, дрожжевого экстракта, маннита, хлористого натрия и агар добавляют в колбу с 100,0 мл дистиллированной воды, доводят до кипения.

Устанавливают pH среды 7,2 и стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 мин. В остуженную до 45°С среду асептически вносят раствор теллурита калия, взвесь желтка куриного яйца и полимиксин, после чего среду разливают в чашки Петри по 25,0 мл. Выросшие колонии стафилококка имеют черный цвет.

з) Среда Baird-Parker (г/100,0 мл) для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптон — 1,0 г
Мясной экстракт — 0,5 г
Дрожжевой экстракт — 0,1 г
Глицин — 1,2 г
Пируват натрия — 1,0 г
Хлористый литий — 0,5 г
Теллурит калия (2,0%-ный раствор) — 0,5 мл
Желток яйца — 5,0 мл
Агар — 2,0
Вода дистиллированная — 100,0 мл

Все навески (кроме раствора теллурита и желтка) размешивают в 100,0 мл дистиллированной воды. Смесь нагревают при перемешивании и кипятят в течение 1 мин до полного расплавления ингредиентов. Устанавливают pH 7,1 и стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Основа среды может храниться в холодильнике в течение 1 мес. Перед употреблением в расплавленную и охлажденную до 45°С основу, соблюдая правила асептики, прибавляют из расчета на 100,0 мл среды 0,5 мл 2%-ного раствора теллурита калия и 0,5 мл эмульсии яичного желтка.

Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри в объеме не менее 20,0 мл на чашку. Чашки со средой могут быть использованы в течение 24-28 ч. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате общепринятым способом.

Выросшие колонии S. aureus имеют черный цвет (за счет восстановления теллура) с зонами просветления и опалесценции (за счет лецитиназы).

и) Основа дифференцирующего агара (с плазмой) для стафилококков HiMedia, Coagulase Mannitol Agar Base. Среду с добавкой плазмы используют для выделения и дифференциации Staphylococcus spp. из патологического материала и для идентификации чистых культур S.aureus по способности коагулировать плазму и ферментировать маннит.

Состав, г/л:
Настой мозга и сердца — 5,0
Гидролизат казеина ферментативный — 10,5
Перевар соевой муки папаиновый — 3,5
Натрия хлорид — 3,5
Маннит — 10,0
Бромкрезоловый пурпурный — 0,02
Агар — 14,5
pH 7,4±0,2

Размешивают 47,0 г среды в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения частиц. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Охлаждают до 45-50°С и асептически добавляют до 7-15% (об.) стерильную предварительно проверенную плазму. Тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

В случае ферментации маннита среда вокруг колонии закисляется, и индикатор бромкрезоловый пурпурный окрашивается в желтый цвет. Если микроорганизмы коагулируют плазму, вокруг их колоний образуется непрозрачная зона. Коагулазоотрицательными видами стафилококка маннит может ферментироваться с образованием желтой зоны, но она не будет мутной.

Готовая среда имеет лиловую окраску, слегка опалесцирует.

к) Среда для выявления термостабильной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) у энтеротоксигенных стафилококков. ДНКаза определяется по методу, основанному на метахроматических свойствах толуидина голубого.

К 1000,0 мл 0,05 М трис-буфера (оксиметиламинометан), pH 9,0, добавляют 0,3 г ДНК, затем 10,0 г агара Difco, 1 мл 0,01 М раствора CaCl₂, 10,0 г хлористого натрия, 3,0 мл 0,1 М раствора толуидина голубого. Среду разливают в пробирки по 12-15 мл, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике до 3-5 мес.

Перед постановкой реакции среду растапливают и разливают в чашки Петри, подсушивают при 37°С в течение 1 ч, стерильно вырезают лунки диаметром 3 мм, отсасывают пипеткой агар и вносят в лунки пастеровской пипеткой взвеси испытуемых культур.

Для этого пробирки с суточным ростом испытуемых культур стафилококков на полужидком питательном агаре прогревают в кипящей водяной бане 15 мин и вносят в лунки в агаровой пластинке, содержащей ДНК и толлуидин голубой инкубируют при 37°С. В результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНКазой стафилококков, образуются зоны просветления с розовым окрашиванием. Появление через 1-2 ч зон, окрашенных в розовый цвет, расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНКазы.

л) Молочно-солевой агар С.Л. Петрович (для определения каротиноидного пигмента стафилококков). К расплавленному мясопептонному агару с pH 7,2±0,2, содержащему 5-7,5% натрия хлорида, добавляют ex tempore 10% стерильного теплого молока, хорошо обезжиренного, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

- Читать далее "Среды для пиогенного стрептококка"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020