а) Цветные среды Гисса с углеводами. Углеводные среды применяют для дифференциации бактерий по способности ферментировать углеводные субстраты.

При ферментации углеводов происходит образование смеси кислот (молочной, уксусной, углекислоты и др.), которые снижают значение pH. Конечными продуктами ферментации углеводов и спиртов в большинстве случаев являются кислоты, спирты, альдегиды и газообразные вещества (H₂ и CO₂).

Для обнаружения ферментации углеводов в среды Гисса вводят индикатор (индикатор Андреде, ВР — водно-голубой и розоловую кислоту, бромтимоловый синий и др.). Для выявления газообразования в жидких средах применяют трубки Durhem — поплавки (маленькие трубочки, запаянные с одного конца). Образующийся газ вытесняет жидкость из поплавков. Газ скапливается у запаянного конца трубки.

В полужидких средах о процессе газообразования судят по пузырькам, разрывам или трещинам, появляющимся в толще агара.

б) Цветные среды Гисса с углеводами (жидкие).

Состав:
Пептон — 10,0 г
Натрия хлорид — 5,0 г
Углевод — 5,0-10,0 г
Индикатор Андреде — 10,0 мл или 1,0 мл 1,6%-ного раствора бромтимолового синего
pH 7,2±0,2

К 1000,0 мл дистиллированной воды добавляют 10,0 г пептона и 5,0 г натрия хлорида. Пептон и соль растворяют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтруют через бумажный фильтр пока среда не станет совершенно прозрачной. Устанавливают pH. Добавляют 5,0-10,0 г одного из испытуемых углеводов (лактозы, глюкозы, маннита, целлобиозы и т.п.), а затем индикатор Андреде или бромтимоловый синий.

Готовую среду разливают по 3,0 мл в пробирки вместе с поплавками, расположенными запаянным концом кверху. Среду стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. Во время стерилизации поплавки доверху заполняются питательной средой.

Готовая среда бесцветная или имеет розовый оттенок — с индикатором Андреде, травянисто-зеленый — с индикатором бромтимоловым синим.

Питательной основой сред для определения ферментации углеводов является пептонная вода. Мясной бульон для этой цели не годится, так как он содержит различные углеводы, что может привести к ложным результатам. Вследствие роста бактерий, сопровождающегося расщеплением углеводов с образованием кислых продуктов распада, цвет среды изменяется: с индикатором Андреде она становится ярко-розовой, с бромтимоловым синим — желтой. Образование газа в среде определяют по наличию пузырьков, собирающихся в поплавке.

в) Среды Гисса с углеводами (полужидкие).

Состав:
Пептон — 10,0 г
Натрия хлорид — 5,0 г
Углевод - 5.0-10,0 г
Индикатор Андреде — 10,0 мл или 1,0 мл 1,6%-ного раствор бромтимолового синего
Агар — 5,0—8,0 г
Вода дистиллированная — 1000,0 мл
pH 7,2±0,2

После растворения ингредиентов в 1000,0 мл подогретой дистиллированной воды среду охлаждают до 50°С, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности. Устанавливают pH, добавляют 5,0-10,0 г одного из необходимых углеводов (лактозу, глюкозу, маннит и т.п.), а затем — индикатор Андреде или бромтимоло-вый синий (32.1.2.4). Готовую среду разливают в узкие стерильные пробирки. Среду стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. В результате роста бактерий, расщепляющих соответствующий сахар, среда, содержащая индикатор Андреде, приобретает ярко-розовую окраску, а среда с бромтимоловым синим из травянисто-зеленой превращается в желтую.

г) Индикатор Андреде. Наиболее широкое применение индикатор Андреде находит при изготовлении дифференциальных сахарных сред Гисса, предназначенных для выявления окисления и ферментации входящих в их состав углеводов.

Состав:
Фуксин кислый — 1,0 г
Натрия гидроксид (NaOH) 1N раствор — 64,0 мл
Вода дистиллированная — 400,0 мл

Фуксин кислый растворяют в гидроксиде натрия, после растворения краски прибавляют 400,0 мл дистиллированной воды, настаивают 24 ч при 37°С в течение суток и 2 сут. держат на свету при комнатной температуре. Сохраняют во флаконе темного стекла с резиновой или хорошо притертой пробкой.

Изменения цвета индикатора Андреде приведены в таблице.

д) Основа бульона с феноловым красным, HiMedia, Phenol Red Broth Base. Основа бульона с феноловым красным — базовая среда, которую после добавления углеводов используют для определения ферментативных свойств чистых культур микроорганизмов, таких как стрептококки, пневмококки и др.

Состав, г/л:
Экстракт говяжий — 1,0
Пептон протеозный — 10,0
Натрия хлорид — 5,0
Углевод — 5,0
Феноловый красный — 0,018
pH 7,4±0,2

Суспендируют 16,0 г сухой смеси в 1000,0 мл дистиллированной воды. Добавляют 0,5% углевода и полностью растворяют. Разливают в пробирки с трубками Durhem. Стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин при 121°С. Для некоторых особенно требовательных штаммов культуральная ценность этой среды может быть существенно увеличена добавлением 0,1-0,2% агара. После инкубации ферментацию углеводов определяют по изменению окраски среды из красной в желтую, а выделение газа — по скоплению пузырьков в поплавках.

е) Триптон-соевый бульон без декстрозы, HiMedia, Tryptone Soya Broth Without Dextrose. Относится к средам с низким содержанием углеводов. Ее можно использовать с добавлением углевода и индикатора на кислотной основе для изучения ферментации у требовательных и нетребовательных микроорганизмов, таких как N.meningitidis, S. pneumoniae, S. pyogenes, Staphylococcus spp.

Состав, г/л:
Триптон — 17,0
Пептон соевый —3,0
Натрия хлорид — 5,0
Калия дигидроортофосфат — 2,5
pH 7,3±0,2

Суспендируют 27,5 г сухой смеси в 1000,0 мл дистиллированной воды. Нагревают до полного растворения. При необходимости добавляют углевод в концентрации 0,5-1,0% и индикатор феноловый красный — 0,02 г/1000,0 мл. Среду разливают в пробирки с поплавками, стерилизуют 15 мин при 121°С. Через 18-48 ч культивирования при 35-37°С учитывают результаты.

Ферментация углеводов сопровождается снижением pH — вызывает изменение красного цвета индикатора на желтый, при газообразовании — скопление пузырьков на дне поплавков.

- Читать далее "Среды для определения гемолитической активности бактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020