Энзиматический гидролиз лактозы является одним из дифференциально-диагностических признаков при изучении патогенных и условно-патогенных бактерий. Последние делятся на 2 основные группы: ферментирующие и не ферментирующие лактозу или, соответственно, лактозопозитивные и лактозонегативные. Этот признак используют при идентификации многих видов микроорганизмов, но основное значение он имеет в диагностике кишечных инфекций при идентификации патогенных и непатогенных энтеробактерий.

При обследовании больных и носителей бактериологи нередко встречаются с лактозоотрицательными или замедленно ферментирующими лактозу штаммами, которые по совокупности проведенных дифференциально-диагностических тестов соответствуют лактозоположительным видам бактерий. При окончательной идентификации культур возникает вопрос об их способности продуцировать Р-галактозидазу, поэтому необходимо прибегать к постановке теста с реактивом ONPG.

Тест основан на том, что фермент β-галактозидаза (лактаза) катализирует расщепление дисахарида лактозы на два моносахарида — глюкозу и галактозу. В ферментативном гидролизе лактозы принимают участие два фермента: β-галактозидаза и ферментоподобный транспортный белок — лактозопермеаза. Синтез лактозопермеазы индуцирует находящаяся в питательной среде лактоза. На наружной поверхности клеточной стенки бактерий пермеаза образует с лактозой прочное соединение.

После проникновения через клеточную стенку на внутреннюю поверхность мембраны конфигурация пермеазы меняется, при этом снижается ее сродство к транспортируемому субстрату. В результате лактоза проникает в клетку, а транспортирующая ее пермеаза диффундирует наружу. Внутри бактериальной клетки лактоза расщепляется β-галактозидазой с образованием свободных моносахаридов — глюкозы и галактозы. При этом лактоза и ее структурный аналог алло-лактоза (один из промежуточных продуктов метаболизма лактозы) выступает в качестве внутриклеточного индуктора β-галактозидазы.

Через 1-2 мин от начала индукции синтез фермента возрастает примерно в 1000 раз и поддерживается на достигнутом уровне, пока в клетке присутствует индуктор. В бактериальных культурах, не синтезирующих лактозопермеазы или испытывающих дефицит в ее образовании, лактоза не сбраживается или процесс сбраживания ее происходит крайне медленно. Причины задержки сбраживания лактозы определяют в реакции с реактивом ONPG.

о-Нитрофенил-β-D-галактопиранозид представляет собой нитрофенилзамещенную галактозу, структурно схожую с лактозой и катализируемую тем же ферментом (β-галактозидазой), который гидролизует лактозу. Из бесцветного реактива ONPG образуются 2 конечных продукта — о-нитрофенил и галактоза. При гидролизе ONPG высвободившийся из соединения о-нитрофенил приобретает присущий ему желтый цвет, придающий соответствующую окраску содержимому пробирки, являясь таким образом индикатором присутствия в исследуемой культуре фермента β-галактозидазы.

Техника постановки теста. Отобранные для исследования колонии снимают бактериальной петлей с любой плотной питательной среды, содержащей лактозу. Содержащуюся в петле культуру эмульгируют в 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Приготовленная взвесь — густая молочного цвета.

В хорошо смешанную гомогенную взвесь добавляют 1 каплю толуола для экстракции фермента из бактериальных клеток. Пробирки после тщательного встряхивания помещают в термостат или на водяную баню на 30-40 мин. После инкубации в термостате к взвеси микробов добавляют 0,25 мл свежеприготовленного бесцветного раствора ONPG. Приготовленную смесь вновь помещают в термостат.

Учет результатов производится через 2-3 и 24 ч инкубации пробирок. При положительном результате (синтез фермента (3-галактозидазы) содержимое пробирок окрашивается о-нитрофенолом в желтый цвет. При отрицательной реакции бесцветный комплекс ONPG не расщепляется и не вызывает изменений цвета микробной взвеси.

Положительный контроль: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca.

Отрицательный контроль: Proteus mirabilis.

- Читать далее "Тест на определение кислотообразования в реакции с метиленовым красным (MR-тест) в идентификации микроорганизмов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 27.05.2019