В настоящее время в биологии широкое распространение получил метод электрохемилюминесценции. Этому в значительной мере способствовала относительная простота и доступность лабораторных установок, быстрота измерений, сравнительно несложный обсчет экспериментальных данных. Кроме того, высокая чувствительность метода позволяет использовать для измерений небольшие количества липидов (порядка 5—10 мг), что является существенным достоинством, учитывая уникальность и сложность биологических опытов.

Следует остановиться на разборе недостатков этого метода, чтобы исключить возможность ошибки в интерпретации экспериментальных данных. К сожалению, теоретические основы метода разработаны недостаточно полно. До сих пор не доказана свободнорадикальная природа реакций, ответственных за возникновение свечения в ЭХЛ системе, не установлена природа эмиттеров свечения. Все это значительно осложняет установление природы действия на ЭХЛ различных добавок.

В одной из первых работ, посвященных ЭХЛ, на которую большинство авторов, использующих этот метод, ссылается как на основополагающую, свободнорадикальная природа свечения доказывается на основании уменьшения интенсивности свечения при введении и систему ряда веществ.

Наиболее эффективными оказались восстановители KJ и Na2S203 в интервале концентраций 10-7—10-5 моль/л, наимоноо эффективны цистеин и b-меркаптоэтиламин в интервале 10~3 — 10-1 моль/л.
Такая большая разница в действующих концентрациях (па 6 порядков) вряд ли может быть объяснена различием эффективности этих веществ как антиоксидантов. Заметим, что в условиях жидкофазного окисления угловодородов восстановители вообще не проявляют ингибирующей активности, а цистеин и меркаптоэтиламин являются лишь слабыми антиоксидаптами, разрушающими гидроперекиси. Вероятно, в данном случае общим свойством этих воществ является их способность окисляться под действием электрического тока. Уменьшение интенсивности свечения может быть вызвано конкурентным соокислением тирозина и перечисленных веществ и не является строгим доказательством свободнорадикального механизма реакции окислении тушения.

Кроме того, в большинстве работ, где используется этот метод, вывод об изменении количества природных антиоксмдантов в липидах делается только на основании изменения интенсивности свечения. Предполагается, что уменьшение интенсивности свечения указывает на увеличение количества природных антиоксидантов, увеличение интенсивности свечения — на уменьшение их количества. Подобная упрощенная трактовка вряд ли допустима для объяснения действия таких многокомпонентных систем, какими являются липиды. Прежде всего необходимо установить механизм тушения.

Ни в одной из работ, посвященных методу ЭХЛ, не рассматривается возможность физического механизма тушения. Присутствие в липидах тушителей или, наоборот, активаторов свечения вносит существенную ошибку в расчетные формулы, используемые авторами. Вопрос о присутствии в системе физических тушителей или активаторов может быть решен только при сопоставлении скорости процесса окисления, измеренной любыми другими способами, и кинетики интенсивности свечения.

В том случае, если ослабление свечения имеет химическую природу, возможны два варианта причин, вызывающих изменение интенсивности свечения системы. Во-нервых, оно может быть вызвано изменением скорости зарождения свободных радикалов в системе, например, из-за возможного соокислепия веществ. Введение в электрохимическую ячейку липидов еще более увеличивает вероятность протекания реакций соокислепия, поскольку в опытах используются достаточно высокие анодные потенциалы, а липиды содержат легкоокисляющиеся компоненты. Эта сторона действия липидов не рассматривается ни в одной работе, хотя все расчеты эффективности липидов делаются при постулировании постоянства скорости инициирования свободных радикалов.

Во-вторых, необходимо иметь в виду, что для липидов могут существовать области различной зависимости интенсивности свечения от концентрации. Поэтому измерепие интенсивности свечения только для одной концентрации липидов явно недостаточно. Необходим анализ формы кинетических кривых интенсивности свечения, ибо с его помощью можно избежать мпогих ошибок, возникающих при механическом переносе закономерностей, присущих определенному процессу, на другой, менее изученный процесс.

В настоящее время метод ЭХЛ насчитывает пять модификаций, которые различаются не только субстратами окисления (цитрат патрия, тирозин, олеиновая и малеиновая кислоты, люминол), но и растворителями (вода, метанол, хлороформ: ацетон, тетраэтиламмонпй бромид : диметилформамид). Такое разнообразие моделей затрудняет сравнение экспериментальных данных, так как необходимо учитывать не только различные реакции, приводящие к возникновению свечения, разные механизмы тушения или активаций, но и влияние полярпости среды окисления, которое весьма существенно.

Значительное влияние среды окисления на величину константы к7 антиоксидантов было установлено на модели инициированного окисления этилбензола. При оценке эффективности антиоксндантов в неполярных средах различия в значениях к7к6 определяются в основном тем, что для разных углеводородов сильпо различаются константы скорости рекомбинации перекисных радикалов (k6). Изменение же полярности среды прежде всего сказывается па скорости взаимодействия ингибитора с перекиспыми радикалами. Так, например, значения константы к7, определенные для 2,4,6-тримотил-3-оксиииридина при инициированном окислении этилбензола и в смеси этилбензол : уксусная кислота (3:2), различаются почти в 100 раз.

Таким образом, но своему существу метод ЭХЛ наиболее близок к модели инициированного окисления углеводородов. И в том, и в другом случае измеряется интенсивность свечения, возникающего при рекомбинации радикалов, и ее изменение при введении липидов, их фракций или веществ биологического происхождения.

Какую же информацию дает метод ЭХЛ? По всей вероятности, этим методом может быть определена суммарная антирадикальная активность липидов, т. е. величина, пропорциональная эффективной константе к7 и действующей доле природных аптиоксидантов липидов. Однако априори нельзя говорить о тождественности или пропорциональности этой величины антиокиелительной активности. Для этого необходимы дополнительные исследования.

- Читать "Модель окисленной олеиновой кислоты. Влияние антиоксидантов на окисление олеиновой кислоты"

1. Антиоксиданты. Что такое антиоксиданты?
2. Общая антиокислительная активность (АОА). Антиокислительная активность липидов
3. Пути торможения окисления. Оценка антиоксидантной активности (АОА)
4. Определение антиокислительной активности (АОА) веществ. Определение активности липидов
5. Окисление метилового эфира олеиновой кислоты. Влияние температуры на антиоксиданты
6. Методы хемилюминесценции для оценки антиоксидантной активности (АОА). Метод инициированного окисления углеводородов
7. Методы электрохемилюминесценции (ЭХЛ). Значение ЭХЛ в определении антиоксидантной активности (АОА)
8. Модель окисленной олеиновой кислоты. Влияние антиоксидантов на окисление олеиновой кислоты
9. Изучение процесса окисления липидов. Окисление ненасыщенных жирных кислот
10. Определение активности липидов по методу Глевинда. Различия антиокислительной и антирадикальной активности