Советуем для ознакомления:

Вирусология:

Популярные разделы сайта:

Радиоиммунологические методы выявления вирусов. Техника радиоиммунных методов

Развитие радиоиммунологических методов анализа антигенов и антител было обусловлено получением препаратов радиоактивных изотопов без носителей, особенно изотопов иода, который легко присоединяется к тирозиновым остаткам в молекуле, белка. Радиоиммунологические методы высокочувствительны; например, метод радиоавтографии клеток, меченных радиоактивными по 125I антигеном или антителами, более чем в тысячу раз чувствительнее методов с использованием флуоресцирующих антигенов или антител.

Кроме того, радиоиммунологические методы очень точны и несложны в исполнении. Один из двух главных реагентов, антиген или антитело, помечен изотопом, поэтому за ним легко следить с помощью стандартных процедур, например радиоавтографии или сцинтилляционного счетчика. При этом необходимо выполнять три основных требования: 1) один из реагентов, антиген или антитело, должен находиться в чистом виде; 2) степень насыщения белка иодом должна быть низкой (менее двух атомов иода на молекулу белка с молекулярным весом 40 000 дальтон), в противном случае серологические свойства белка могут измениться; 3) процесс иодирования не должен изменять серологических свойств.

Существует два основных метода иодирования белков. При использовании первого метода добавленный к белку иодид окисляется окислителем, обычно хлорамином-Т. Эта процедура эффективна, но ее недостатком следует считать возможность легкого окисления остатков метионина, что иногда приводит к изменению серологических свойств белка.

выявление вирусов

По второму методу иодид, добавленный к белку, окисляется ферментом лактопероксидазой, внесенной в реакционную смесь (Марчалонис, 1969). Последний метод более специфичен и меньше повреждает антиген, однако белок при этом иодируется в меньшей степени.

Широко используют два типа радиоиммунологических методов: радиоиммунозлектрофорез и радиоиммунодиффузию. В основе обоих методов лежит общий принцип, состоящий в том, что глобулины, обладающие активностью антител, даже после преципитации антисывороткой против глобулина могут реагировать с антигеном. Например, для того чтобы узнать, какой класс молекул антител, специфически реагирующих с данным антигеном, присутствует в сыворотке, используют следующий подход. Препарат исследуемой сыворотки подвергают обычному иммуноэлектрофорезу в агаровом геле, нанесенном на предметные стекла. Затем в гель диффундирует антиглобулиновая сыворотка, образуя при этом дуги преципитации, соответствующие различным классам антител.

Предметные стекла с агаром и реагентами тщательно отмывают, после чего в гель диффундирует радиоактивный антиген. Стекла снова отмывают, окрашивают и радиоавтографируют. Наложив пленку с радиоавтографом на окрашенное стекло, можно идентифицировать радиоактивные дуги и тем самым специфические антитела.

Несмотря на свою полезность, эта методика не позволяет легко провести количественное определение специфических антител (или антигенов). Эту задачу можно решить несколькими способами (Хорвиц и Шарф, 1969b), один из которых заключается в следующем (Уистар, 1968). Аликвоты меченного 125I антигена (или антител) смешивают с серийными разведениями антисыворотки (или антигена), добавляют соответствующее количество антиглобулиновых антител, смесь инкубируют 3 ч при 37 °С и оставляют на 16 ч при 4 °С. Затем смесь центрифугируют в режиме, при котором осаждаются комплексы антигена, антител и антиглобулиновых антител, но не свободные антигены или антитела. Радиоактивность отмытого осадка определяют с помощью сцинтилляционного счетчика.

- Вернуться в оглавление раздела "Вирусология"

Оглавление темы "Выявление вирусов":
1. Критерии чистоты вирусных препаратов. Радиоактивные изотопы в изучении вирусов
2. Электронная микроскопия вирусов. Гибридизация вирусов
3. Гибридизация ДНК вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов
4. Диагностика вирусных нуклеиновых кислот. Белки вирусов
5. Белковый состав морфологических субъединиц вирусов. Оболочки и ферменты вирусов
6. Антитела и антигены вирусов. Нейтрализация вирусов
7. Торможение гемаглютинации вирусов. Выявление вирусов диффузией в геле
8. Связывание комплемента для выявления вирусов. Техника связывания комплемента
9. Иммунофлуоресценция вирусов. Виды иммунофлуоресценции вирусов
10. Радиоиммунологические методы выявления вирусов. Техника радиоиммунных методов

Если остались вопросы - смело задавайте: