Бактериологический метод исследования является основным методом микробиологической диагностики хеликобактериоза, позволяющим получить наиболее полное представление о биологических характеристиках штамма Н. pylori, выделенного от того или иного пациента, и сопоставить их с особенностями клинического течения соответствующего заболевания.

а) Отбор образцов биологического материала. Особенности распределения популяции Н. pylori по слизистой оболочке желудка, рассмотренные выше, в полной мере определяют тактику отбора образцов биологического материала для бактериологического исследования. В дополнение к четырем образцам слизистой оболочки желудка, отобранным для микроскопического исследования, в ходе верхней эзофагогастродуоденоскогши отбираются два дополнительных — по одной с малой кривизны антрального отдела и тела желудка. Точки отбора следует располагать в максимальной близости (3-5 мм) от точек отбора материала для микроскопического исследования.

Бактериологический метод исследования предполагает безусловное соблюдение требований асептики при отборе биологических проб. В применении к эндоскопическому исследованию выполнение этих требований означает осуществление стерилизационной обработки не только внешней поверхности гастроскопа, но и внутреннего его канала и форцепта непосредственно по окончании каждого единичного эндоскопического исследования. Пренебрежение требованием стерилизации эндоскопической аппаратуры неизбежно приводит к сохранению на рабочих поверхностях форцепта и внутренних стенках канала эндоскопа частиц биологического материала, потенциально инфицированных Н. pylori.

Повторное использование нестерильной аппаратуры чревато как контаминацией неинфицированных образцов частицами биологического материала, неизбежно приводящее к получению ложноположительных результатов бактериологического исследования, так и ятрогенным инфицированием гастро-гастральным путем неинфицированного ранее пациента. Однако, как это ни досадно, технические и организационные особенности эксплуатации эндоскопической техники в реальных условиях работы лечебно-профилактических учреждений далеко не всегда способствуют неукоснительному выполнению рассмотренных выше требований асептики.

Извлеченный из внутреннего канала эндоскопа и удерживаемый браншами форцепта отобранный биопсийный образец слизистой оболочки желудка немедленно помещают в транспортную среду того или иного состава. В случае использования полужидких питательных сред биопсийный образец проталкивают форцептом до нижней трети столбика питательной среды, где он и удерживается после разведения браншей и извлечения инструмента.

б) Хранение и транспортировка образцов. Выбор режима хранения и транспортировки отобранных образцов определяются степенью отдаленности эндоскопического кабинета от бактериологической лаборатории. При расположении их на территории одного и того же лечебного учреждения с успехом может быть использован 20%-ный стерильный раствор глюкозы, в 3-5 мл которого образец слизистой оболочки желудка в течение 30-45 мин сохраняет изначальный уровень обсемененности Н. pylori. Использование 0,9%-ного раствора хлорида натрия может быть использовано лишь в исключительных случаях и только при условии, что транспортировка образца в бактериологическую лабораторию осуществляется немедленно после его отбора и отнимает несколько минут.

Во всех прочих случаях, когда транспортировка образца занимает от 1 до 6-8 ч, следует использовать транспортные питательные среды, содержащие в достаточном количестве аэропротектор — легко окисляющееся вещество, защищающее Н. pylori от разрушительного для него действия атмосферного кислорода. Наилучшими протекторными свойствами обладает полужидкая среда Кэри-Блэйр (см. 32.2.2.13) с 1,5% тиогликолята натрия. На ней биопсийные образцы слизистой оболочки желудка, защищенные от высыхания и окисления, сохраняются без потери своих биологических свойств при комнатной температуре до 12 ч, при 4°С — до 36 ч. До 72 ч при комнатной температуре биопсийные образцы вполне успешно сохраняются на транспортной среде оригинального состава «Portagerm pylori» («bioMerieux», Франция). Как показывает практика, добавление к транспортной среде активированного угля не оказывает существенного влияния на выживаемость на ней Н. pylori.

в) Классическая аранжировка бактериологического метода исследования. В соответствии с методологическими требованиями классической бактериологии, чистая культура бактерии может быть выделена из изолированной колонии, выросшей на плотной питательной среде при посеве на нее исследуемого биологического материала. Выделенная культура подлежит идентификации с видовой степенью точности, необходимой для постановки лабораторного микробиологического диагноза: название вида микроорганизма, ассоциированного с тем или иным биологическим материалом.

Питательные среды. Важнейшим требованием, предъявляемым к искусственным питательным средам для выделения Н. pylori из биологического материала, является возможно более полное восполнение питательных потребностей этой бактерии. Учитывая, что Н. pylori в качестве источника энергии и азота широко использует глюкозу и аминокислоты, питательные среды, применяемые для его выделения, должны содержать их в достаточном количестве. Такие среды изготавливают из гидролизатов мышечной ткани глубокой степени расщепления вплоть до свободных аминокислот и олигопеитидов. Иными словами, для выделения Н. pylori требуются питательные среды с высокими (более 1,2 г/л) значениями индекса аминного азота — показателя, отражающего уровень содержания в искусственной питательной среде свободных аминокислот. Питательные потребности Н.pylori в полной мере могут быть восполнены на таких питательных основах, как «Columbia Agar», «Brain Heart Infusion Agar», «Blood Agar Base», «GC Agar Base», «Brucella Agar» и проч. Ведущими производителями искусственных питательных сред эти основы выпускаются в виде сухих коммерческих продуктов.

В то же время, не теряют своего значения и некоммерческие питательные композиции, изготавливаемые в бактериологических отделениях из коммерческих питательных основ. Примером такой композиции является среда 94, в течение многих лет использующаяся в отечественной бактериологической практике для выделения Н. pylori из биопсийных образцов слизистой оболочки желудка.

Биологические добавки являются неотъемлемой составляющей искусственных питательных сред для выделения и культивирования Н.pylori. Наилучшие результаты дает добавление к искусственной питательной среде нормальной лизированной лошадиной крови либо смеси нормальной лошадиной сыворотки с «шоколадной» (разрушенной прогреванием при повышенной температуре) лошадиной кровью, В обоих случаях питательная среда обогащается биологическими добавками, в изобилии содержащимися в крови, в частности, в строме ее эритроцитов. Относительно приемлемым может расценено добавление к питательной основе цельной бараньей крови, гемоглобина, гемина, различных патентованных добавок типа «IsoVitalex», «Vitex» и т.п., содержащих разнообразные факторы роста бактерий. Следует избегать добавления к питательной основе донорской человечьей крови, зачастую содержащую антибиотики, и в подавляющем большинстве случаев — антитела к Н. pylori.

Известно, что в естественных условиях обитания Н. pylori населяет нестерильный биотоп, уровень обсемененности которого сопутствующей бактериальной флорой возрастает прямо пропорционально росту значений ее pH. В этой связи добавление к искусственной питательной среде селективных для Н. pylori добавок, подавляющих рост сопутствующей флоры, выглядит вполне методически оправданным. Многочисленные известные сегодня селективные добавки сконструированы по единому принципу: они содержат ингибиторы кокковой, кишечной палочковидной и грибковой микрофлоры, взятые в различных соотношениях друг с другом. В ряде случаев к искусственной питательной среде добавляют хлорид трифенилтетразолиума — вещество, легко восстанавливающееся Н. pylori с образованием характерного пигмента. Добавление к искусственной питательной среде хлорида трифенилтетразолиума придает ей в дополнение к селективным дифференциальнодиагностические качества.

Анализируя оптимальный для выделения и культивирования Н. pylori состав искусственных питательных сред, легко убедиться, сколь трудоемким, с одной стороны, является процесс их лабораторного приготовления, и сколь трудно выполнимым, с другой стороны, является требование стандартизации этих сред.

Первичный высев и культивирование. Первый этап. Сразу же после извлечения бактериологической петлей из толщи транспортной среды биопсийный образец высевают на поверхность свежеприготовленной и подсушенной среды первичного культивирования, разлитой по вентилируемым чашкам Петри. Принимая во внимание, что слизистая оболочка желудка не является легко гомогенизирующимся материалом, который можно без остатка растереть по поверхности плотной питательной среды, посев в сущности представляет собой прокатывание плотного материала по поверхности среды с целью возможно более полной ее контаминации.

По завершении процедуры посева биопсийный образец помещают в центральную область поверхности плотной питательной среды. Хотя в большинстве случаев для выделения Н. pylori используются селективные и селективно-диагностические питательные среды, в ряде случаев, в первую очередь, при оценке эффективности эрадикационной терапии, возникает необходимость в высеве на неселективную среду. В подобных случаях первичный высев производится сначала на неселективную, а затем путем переноса на нее биопсийного образца — на селективную (селективнодиагностическую) питательную среду.

После выполнения первичного высева посевы немедленно помещают в микроанаэростат для создания оптимальной по составу атмосферы и абсолютной влажности. Как отмечалось выше, Н. pylori является микроаэробной и капнофильной бактерией, требующей для культивирования in vitro следующего объемного состава атмосферы: 5% кислорода, 10% углекислоты, 85% азота. Создание искусственной атмосферы в герметически замкнутом внутреннем пространстве микроанаэростата возможно двумя принципиально различными способами: аэромеханическим либо химическим. Аэромеханический способ предполагает наличие газовой атмосферы фиксированного состава, содержащейся под избыточным давлением в газовых баллонах и подающейся во внутреннее пространство микроанаэростата по газопроводу соответствующей конструкции. Химический способ основан на использовании газогенерирующих-газопоглощающих пакетов — смеси неорганических солей, при увлажнении частично поглощающих кислород внутреннего пространства микроанаэростата и выделяющих необходимое количество углекислоты. В обоих случаях абсолютно необходимо использование вентилируемых чашек Петри, конструкция которых не допускает герметически плотного замыкания чашки крышкой.

После создания тем или иным способом оптимальных для культивирования Н. pylori условий микроанаэростаты помещаются в суховоздушный термостат для культивирования при 37"С в течение 7-10 сут. с просмотром посевов на третьи (четвертые), пятые (шестые), седьмые (восьмые) и десятые сутки инкубации.

Выделение и идентификация чистых культур. Второй этап. Изолированные колонии, выросшие на поверхности искусственной питательной среды после высева на нее биопсийного образца слизистой оболочки желудка, изучают при увеличении х16 с применением бинокулярной лупы. Изолированные колонии И. pylori, выросшие на искусственных питательных средах, не содержащих хлорида трифенилтетразолиума (неселективных и селективных), обладают следующими культуральными свойствами: имеют округлую форму, диаметр не более 1 мм (на третьи сутки инкубации), ровные края, слегка возвышаются над поверхностью среды, не прорастая ее толщу, по периферии окружены узкой прозрачной зоной при непрозрачном матовом центре, по мере удлинения срока инкубации принимающем вид «апельсиновой корки», с рефлексом, возникающим при боковом освещении, легко отделяются от поверхности плотной питательной среды. Наличие в составе питательной среды хлорида трифенилтетразолия придает изолированным колониям исключительно важный дифференциально-диагностический признак: восстановленные до формазана формы этого соединения окрашивают центральную часть изолированных колоний рубиново-красным пигментом с золотистыми вкраплениями.

При скученном расположении изолированных колоний рубиново-красный пигмент распространяется за пределы колоний и окрашивает поверхность питательной среды узкими штрихами. Из материала изолированных колоний, обладающих описанным выше набором культуральных признаков, на неселективной питательной среде описанного выше состава выделяется чистая культура, подлежащая идентификации.

Третий этап. Культура грамотрицательных изогнутых палочек, выделенная из биопсийного образца слизистой оболочки желудка в микроаэробной атмосфере в присутствии селективной смеси и обладающая описанным выше набором культуральных признаков, с высокой вероятностью может быть отнесена к виду Helicobacter pylori. Наличие у такой культуры оксидазной, каталазной и уреазной активности позволяет окончательно подтвердить подобное предположение.

Помимо фенотипической идентификации, в диагностической практике находит применение и генотипическая идентификация: молекулярное зондирование и полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяют идентифицировать выделенную культуру на основании обнаружения в ее материале фрагментов генома, свойственных исключительно виду Н. pylori. Наиболее часто генотипическая идентификация опирается на обнаружение фрагментов гена, кодирующего последовательность 16S РНК, генов ureC, vacA, hpaA.

г) Хранение выделенных культур. Весьма чувствительный к воздействию факторов окружающей среды, Н. pylori чувствителен и к процедуре лиофильного высушивания. Подобное обстоятельство относит проблему музейного хранения его культур к категории трудноразрешимых. Оптимальным способом ее разрешения является хранение в условиях глубокого замораживания на средах с криопротектором. 'Гак, на среде с глицерином при -70°С культура Н. pylori сохраняет жизнеспособность около одного года, использование лизированной лошадиной крови с глицерином позволяет увеличить срок хранения культур до 2 лет.

д) Определение чувствительности к антибиотикам. Хотя стартовая терапия хронического гастрита и язвенной болезни остается эмпирической, оценка чувствительности выделенных культур к антибиотикам сохраняет свою актуальность. Во-первых, стартовая терапия далеко не во всех случаях оказывается успешной: по самой оптимистической оценке эрадикация популяции Н.pylori достигается в 65-70% случаев, и причиной тому часто оказывается резистентность штамма Н.pylori к избранному для лечения антибиотику. В подобных случаях результаты экспериментов по оценке чувствительности культуры к антибиотикам могут оказаться полезными для корректировки курса эрадикационной терапии. Во-вторых, при эмпирическом назначении того или иного антибиотика учитываются сведения о спектре природной резистентности к антибиотикам штаммов, циркулирующих в данном регионе. Иными словами, адекватная оценка чувствительности к антибиотикам штаммов Н. pylori, выделяемых в разных регионах, позволяет планировать рациональную эмпирическую стартовую терапию хеликобактериоза в ближайшей перспективе.

Для оценки чувствительности свежевыделенных культур H. pylori к антибиотикам применяются четыре теста (мы их перечисляем в порядке возрастания достоверности обеспечиваемых ими результатов): дискодиффузионный, эпсилометрический (Е-тест), серийных разведений в плотной питательной среде, серийных разведений в жидкой питательной среде. Постановка всех четырех тестов требует использования жестко стандартизированной по оптической плотности (мутности) взвесей материала тестируемой культуры, а также стандартных питательных сред, препаратов антибиотиков и антибиотиксодержащих носителей (стандартных дисков и Е-полос). Кроме того, безусловно необходимой является постановка контрольных экспериментов с использованием эталонных штаммов H. pylori.

Для постановки теста серийных разведений в жидкой питательной среде может быть с успехом использован бульон для бруцелл «Brucella Broth» с нормальной лошадиной сывороткой, для постановки трех прочих тестов — «Columbia Agar» с лизированной лошадиной кровью.

Дискодиффузионный тест выполняется по обычной методике: поверхность свежеприготовленной и тщательно подсушенной плотной питательной среды инокулируется материалом взвеси испытуемой культуры, после чего на подсушенный газон укладываются стандартные диски с антибиотиками, в обязательный набор которых входят ампициллин, тетрациклин, кларитромицин, азитромицин, метронидазол, пефлоксацин, ципрофлоксацин, рифампицин. Учет результатов производится путем измерения диаметров зон задержки роста культуры вокруг каждого диска, возникших по истечении 48 ч инкубации в описанном выше режиме. Полученные результаты сопоставляются с табличными значениями диаметров зон задержки роста, соответствующими чувствительности, промежуточному состоянию и резистентности к тому или иному антибиотику.

Дискодиффузионный тест, подкупающий своей нетрудоемкостью, позволяет получить лишь качественные результаты, тогда как три прочих теста дают возможность, хотя и с различной степенью точности, произвести количественную оценку степени чувствительности культуры к тому или иному антибиотику, т.е. оценить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) его по отношению к той или иной культуре.

Постановка эпсилометрического теста (Е-теста) мало отличается от постановки дискодиффузионного теста. На инокулированную поверхность по радиусу чашки укладываются полосы нитроцеллюлозы, содержащие градиент концентрации какого-либо антибиотика, промежуточные значения концентрации которого указаны на лицевой стороне носителя. Учет результатов производится визуально: расположение эллипсовидной границы зоны задержки роста однозначно соответствует концентрации антибиотика в этой точке, на что и указывает ближайшее к границе зоны численное значение.

Тест оценки чувствительности к антибиотикам на плотной питательной среде, являющийся наиболее трудоемким и дорогостоящим, но и наиболее точным, предусматривает приготовление батареи чашек со средой «Columbia Agar» с лизированной лошадиной кровью, содержащих возрастающие концентрации того или иного антибиотика. Поверхность питательной среды инокулируется каплей взвеси испытуемой культуры (как правило, поверхность одной чашки в целях экономии средств инокулируется взвесью нескольких испытуемых культур). Учет результатов производится визуально. В качестве МПК того или иного антибиотика расценивается та его концентрация, при которой впервые в возрастающем ряду концентраций антибиотика отсутствует видимый рост испытуемой культуры.

Постановка теста оценки чувствительности к антибиотикам на жидкой питательной среде эквивалентна предыдущей, с гой лишь разницей, что возрастающие концентрации антибиотиков вносятся в жидкую питательную среду, инокулируемую определенным объемом взвеси испытуемой культуры. Учет результатов теста также осуществляется визуально. В качестве МПК того или иного антибиотика расценивается та его концентрация, при которой впервые в возрастающем ряду концентраций антибиотика отсутствует видимый рост испытуемой культуры, регистрируемый в виде помутнения питательной среды.

«Золотой стандарт» микробиологической диагностики хеликобактериоза. Исходный вариант «золотого стандарта» диагностики хеликобактериоза, логически вытекающий из положений Сиднейской классификации гастритов, не утратил своего значения и в настоящее время, хотя претерпел изменения, продиктованные требованиями времени.

Согласно требованиям «золотого стандарта» факт присутствия Н.pylori в слизистой оболочке желудка считается установленным, если он обнаружен при помощи микроскопического и (или) бактериологического методов исследования как минимум в одном из шести образцов слизистой оболочки желудка, отобранных в соответствии с требованиями Сиднейской классификации гастритов. При этом подразумевается, что микроскопический метод исследования выполняется одномоментно с гистологическим (но не с цитологическим), а бактериологический — в классической (но не в ускоренной) аранжировке. Внедрение в лабораторную диагностическую практику разнообразных методик ускоренной бактериологической диагностики хеликобактериоза повлекло за собой попытки расширить «золотой стандарт», зачастую необоснованные. Безусловное право на включение в «золотой стандарт» диагностики хеликобактериоза имеет лишь дыхательный тест, чувствительность и специфичность которого приближаются к абсолютным, и электронно-микроскопическое исследование, существенно повышающее чувствительность и специфичность микроскопического метода исследования. Недостаточно высокая чувствительность и (или) специфичность прочих рассматривающихся ниже методик ускоренной диагностики хеликобактериоза требует весьма осторожного применения их в диагностических целях, во всяком случае весьма осторожной клинической интерпретации даваемых ими результатов.

- Читать далее "Методы экспресс-диагностики хеликобактер пилори (H. pylori)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 11.1.2020