В микробиологической диагностике хеликобактериоза находят применение все три основным метода микробиологии — микроскопический, бактериологический и серологический. Особенности патогенеза хеликобактериоза определяют сроки и кратность выполнения того или иного диагностического исследования, выбор диагностического метода, тактику отбора, хранения и транспортировки биологического материала. Биологическое своеобразие Н. pylori, анатомо-физиологические особенности колонизируемого им биотопа, требования клинической практики диктуют необходимость и обусловливают возможность применения нетрадиционных аранжировок каждого метода исследования.

Популяция Н. pylori распределена по слизистой оболочке желудка неравномерно: она имеет разную численность в антральном отделе желудка и его теле; кроме того, местами ее обитания являются как поверхность эпителиального пласта, так и толща покрывающей этот пласт желудочной слизи. Поэтому достоверные результаты диагностического исследования при помощи микроскопического метода могут быть получены лишь при изучении нескольких образцов слизистой оболочки.
В соответствии с Сиднейской классификацией гастритов, исследованию подлежат четыре образца — по два из антрального отдела и из тела желудка. Кроме того, в Сиднейской классификации гастритов факт присутствия Н. pylori в слизистой оболочке желудка не рассматривается в отрыве от патоморфологической характеристики гастрита, в связи с чем микроскопический метод диагностики хеликобактериоза выполняется одномоментно с гистологическим. При язвенной болезни и раке желудка допустим отбор двух образцов слизистой оболочки антрального отдела желудка.

В ряде случаев микроскопическая диагностика хеликобактериоза осуществляется одномоментно с цитологической. Недостатки цитологического метода в диагностике хеликобактериоза очевидны: во-первых, он не позволяет оценить степень выраженности гастрита; во-вторых, выявляет бактериальные клетки, расположенные главным образом в толще желудочной слизи, но не на поверхности эпителиального пласта.

Отбор образцов биологического материала. Образцы слизистой оболочки желудка для гистологического исследования отбирают в ходе верхней эзофагогастродуоденоскопии, которая выполняется в условиях эндоскопического кабинета. Для отбора образцов предпочтительно использование форцепта (эндоскопических щипцов) среднего размера, позволяющего получить образцы размером около 1x1x1 мм. Образцы слизистой оболочки антрального отдела желудка отбирают с малой и большой кривизны в точках, отстоящих на 1,5-2 см от пилорического сфинктера. Образцы слизистой оболочки тела желудка берут также с малой и большой кривизны в точках, отстоящих на 1,5-2 см от границы тела и антрального отдела.

Отобранные образцы немедленно помещают в фиксирующие растворы того или иного типа в зависимости от избранной техники микроскопического исследования. Из образцов, подлежащих цитологическому исследованию и отобранных в соответствие с приведенной выше схемой, немедленно изготавливают мазок-отпечаток.

Микроскопирование. Последующая обработка образцов и изготовление препаратов выполняются в патоморфологических лабораториях в зависимости от избранной техники микроскопического исследования.

Световое микроскопирование. Гистологические препараты, предназначенные для изучения в световом микроскопе, окрашивают тем или иным способом, в выборе которого следует руководствоваться соображением, что микроскопическая картина должна быть оптимальной как для выявления клеток 11. pylori, так и для оценки степени выраженности гастрита. Используются следующие способы окраски: толуидиновым синим, карболовым фуксином, гематоксилином и эозином, по Романовскому—Гимзе, по Граму, по Вортину—Стэрри, по Генте.

Препараты для цитологического исследования с успехом могут быть окрашены любым из перечисленных способов, хотя на практике предпочтение отдается относительно нетрудоемким.

Сиднейская классификация гастритов предусматривает оценку степени выраженности воспаления, активности гастрита, атрофии слизистой оболочки, метаплазии ее эпителия, а также степени обсемененности Н.pylori. Последняя оценивается полуколичественно как слабая, умеренная и тяжелая в зависимости от числа обнаруженных в единичном поле зрения бактериальных клеток. В отечественной диагностической практике зачастую применяется иная система количественной оценки степени обсемененности слизистой оболочки желудка Н. pylori. Различают четыре степени обсемененности, соответствующие 0-20, 20-50, 50-100 и более чем 100 бактериальных клеток в поле зрения.
Естественно, микроскопический метод исследования с применением светового микроскопирования оказывается достаточно чувствительным и специфичным лишь при относительно высокой степени обсемененности слизистой оболочки желудка. При низкой же степени обсемененности чувствительность и специфичность метода оставляют желать лучшего: единичные объекты, напоминающие бактериальные клетки, обнаруживаются лишь изредка и идентифицируются исключительно по морфологическому критерию с той степенью точности, которую этот критерий может гарантировать.

Сказанное в полной мере относится и к цитологическому исследованию, с тем лишь дополнением, что оценка степени обсемененности исследуемого материала H.pylori носит значительно более субъективный характер.

Люминесцентное микроскопирование. Чувствительность и специфичность микроскопического метода исследования в диагностике хеликобактериоза могут быть существенно повышены при использовании люминесцентного микроскопирования препаратов, окрашенных акридиновым оранжевым. Различия в окраске бактериальных клеток, эпителиальной ткани и лейкоцитов, возникающие при освещении препарата ультрафиолетовым светом, облегчают выявление и повышают достоверность идентификации H.pylori.

Иммунофлуоресцентное микроскопирование. Применение реакции непрямой иммунофлуоресценции еще более повышает чувствительность и специфичность микроскопического метода исследования. Решающее значение имеет качество используемых антисывороток к H.pylori и иммуноглобулину IgG человека. Лишь высококачественные антисыворотки способны обеспечить минимальный уровень перекрестных реакций с эпителиальной тканью и, следовательно, частоту возникновения ложноположительных результатов.

Иммуноцитохимическое исследование. Наиболее достоверные результаты микроскопического метода исследования могут быть получены при применении иммуноцитохимических методик, опирающихся на применения моноклональных антител к антигенам как H.pylori, так и разнообразных антигенов эпителиальной ткани. Высокая стоимость реагентов ограничивает их применение в повседневной практике лечебных учреждений.

Электронно-микроскопическое исследование. Электронно-микроскопические технологии, все шире внедряемые в диагностическую практику, позволяют поставить микроскопическую диагностику хеликобактериоза на принципиально новую методическую основу. Весьма высокая чувствительность и абсолютная специфичность методик электронно-микроскопического исследования делают их незаменимыми при микроскопической диагностике состояний, ассоциированных с заведомо низкой обсемененностью исследуемого материала, в первую очередь, при оценке эффективности эрадикационной терапии в относительно ранние сроки.
Кроме того, лишь электронно-микроскопическое исследование позволяет с полной достоверностью выявлять формы H.pylori с дефектной клеточной стенкой и оценивать степень выраженности таких дефектов. Как и иммуноцитохимические, электронно-микроскопические исследования отличаются высокой стоимостью и, кроме того, для своего выполнения требуют участия немедицинского технического персонала высокой квалификации.

- Читать далее "Бактериологический метод диагностики хеликобактер пилори (H. pylori)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 11.1.2020