ГОСТ 28566-90 (СТ СЭВ 6646-89) Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества энтерококков

а) Выявление наличия (отсутствия) энтерококков в определенном количестве продукта. Навеску продукта определенной массы (или объема) либо ее эквивалентное разведение высевают в жидкую питательную среду (азидно-глюкозный бульон или щелочная полимиксиновая среда). Соотношение между количеством инокулята и питательной среды должно составлять 1:5. Посевы культивируют при 37(±1)°С в течение 24-48 ч.

Через 48 ч проводят окончательный учет результатов посева. Отбирают для дальнейшего исследования посевы с признаками роста микроорганизмов (помутнение, появление желтой окраски). Производят пересев положительных посевов на поверхность селективно-диагностической среды (селективный агар по Сланецу и Бертли, или канамицин-азидно-эскулиновый агар, или молочно-ингибиторная среда) методом истощающего штриха. Посевы инкубируют при 37(±1)°С в течение 24-48 ч.

Отмечают наличие колоний, характерных для энтерококков. Для дальнейшего подтверждения принадлежности выделенных колоний к энтерококкам отбирают не менее 5 характерных колоний и пересевают их истощающим штрихом на поверхность глюкозо-триптозного агара с дрожжевым экстрактом с pH 7,2(±0,1). Посевы инкубируют при 37(±1)°С в течение 24-48 ч.

Из выросших колоний готовят мазки и окрашивают их по Граму. Энтерококки представляют собой грамположительные кокки, располагающиеся в мазках парами, короткими или длинными цепочками.

У выращенных культур также определяют наличие каталазы. Энтерококки каталазу не образуют.

Таким образом, если при изучении культуральных и морфологических свойств выделенных микроорганизмов обнаружены грамположительные не образующие каталазу кокки, то делают вывод, что эти микроорганизмы относятся к энтерококкам. Если при подтверждении хотя бы одной характерной колонии, выросшей на селективно-диагностической среде, обнаружены энтерококки, то дают заключение о наличии энтерококков в навеске продукта, взятой для посева.

б) Определение количества энтерококков в 1 г (см³) продукта. Для количественного определения энтерококков используют метод посева на плотные среды. По 0,1 или 0,2 см³ продукта или его разведения вносят на поверхность подсушенной селективно-диагностической среды (селективный агар по Сланецу и Бертли, или канамицин-азидно-эскулиновый агар, или молочноингибиторная среда) в двух параллельных чашках Петри.

Посевной материал равномерно распределяют по всей поверхности агаровой пластинки при помощи стерильного стеклянного шпателя. Чашки подсушивают, переворачивают и инкубируют при 37(±1)°С в течение 24-48 ч.

Для подсчета отбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных для энтерококков. Для подтверждения принадлежности к энтерококкам отбирают не менее 5 таких колоний. Далее поступают, как описано в отдельной статье на сайте. Если при подтверждении характерных колоний не менее четырех из выбранных пяти (т. е. не менее 80%) можно отнести к энтерококкам, то считают, что все характерные колонии на чашке Петри принадлежат энтерококкам. В остальных случаях количество энтерококков определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Пересчет количества энтерококков на 1 г (см³) продукта осуществляют по формуле:

M = NC/m,

где М — количество микроорганизмов в 1 г (см³) продукта;
N — степень разведения навески;
m — количество инокулята, внесенное для посева в чашку Петри;
С — округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Конечный результат вычисления выражают числом от 1,0 до 9,9x10ⁿ.

в) Дополнительные тесты идентификации энтерококков. При необходимости углубленного анализа или при эпидемиологическом обследовании требуется более детальное подтверждение принадлежности выделенных микроорганизмов к энтерококкам. Для этого выделенные культуры исследуют на возможность роста при 45 °С и исследуют их терморезистентность, а также выявляют способность расти при щелочных значениях pH, высоком содержании NaCl и желчи в среде.

Для выявления способности расти при температуре 45(±1)°С исследуемые культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом (pH 7,2±0,1). Посевы культивируют при 45(±1) °С в течение 48-72 ч. Энтерококки хорошо растут при указанной температуре, вызывая помутнение среды.

Для теста на терморезистентность культуры также высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с нейтральным значением pH. Посевы термостатируют при температуре 60(±1)°С в течение 30 мин, затем инкубируют при 37(±1)°С в течение 24-48 ч. Энтерококки терморезистентны, следовательно, растут после термообработки и вызывают помутнение среды.

Для выявления способности расти при высоком содержании NaCl в среде (массовая концентрация NaCl 65 г/дм³) культуры высевают в солевой бульон и культивируют при 37(+1)°С в течение 24-48 ч. Энтерококки вызывают помутнение среды и выпадение осадка. Исключение составляет Е. avium, который на среде с такой концентрацией NaCl не растет или растет очень медленно.

Для определения возможности роста при высоких значениях pH культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом (pH 9,6) и инкубируют при 37(±1)°С в течение 24-48 ч. Энтерококки хорошо растут в щелочной среде и, следовательно, вызывают помутнение среды.

Для выявления способности расти при высоком содержании желчи в среде, культуры высевают в 40% желчный бульон и выдерживают при 37(±1)°С в течение 24-48 ч. Энтерококки способны к росту в желчных средах и вызывают помутнение среды.

Таким образом, при подтверждении характерных колоний, выросших на селективно-диагностических средах, к энтерококкам относят грамположительные, не образующие каталазу кокки, терморезистентные, способные расти при 45 °С, а также в средах с 65 г/дм³ NaCl, 40% желчи и при pH 9,6.

- Читать далее "Выявление бактерий рода Proteus в пищевых продуктах"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.10.2019