Выявление бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах

Метод предназначен для выявления в определенной навеске продукта бактерий рода Salmonella. Для этого определенное количество продукта высевают в жидкую неселективную среду, после инкубирования которой производят посев в жидкие селективные среды. Затем полученные культуры пересевают на плотные дифференциально-диагностические среды. Выросшие на этих средах характерные колонии исследуют, выявляя характерные для сальмонелл биохимические и серологические признаки.

а) Неселективное предварительное обогащение. Необходимую навеску продукта высевают в забуференную пептонную воду. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды при этом должно составлять 1:9. Посевы инкубируют при 36(±1)°С в течение 18-20 ч.

Доводят pH до 7,0(±0,2) жидких высококислотных продуктов — перед посевом, а твердых высококислотных продуктов — в посевах. Для этого используют стерильные растворы гидроокиси натрия и соляной кислоты.

В ряде случаев предварительное неселективное обогащение можно не производить (при анализе колбасных изделий и продуктов из мяса, яичных продуктов, мяса).

б) Селективное обогащение. По 10 см3 полученных в результате предварительного обогащения культуры пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого используют по 100 см3 магниевой и тетратионатной сред или по 100 см3 селенитовой и тетратионатной среды. В ряде случаев помимо перечисленных сред допускается использование среды Мюллера (при анализе яичных продуктов). Посевы культивируют в течение 24-48 ч при 36(±1)°С (магниевая и селенитовая среда) и 43(+1)°С (тетратионатная среда).

в) Выделение культур на плотных дифференциально-диагностических средах. Через 24 и 48 ч инкубирования микроорганизмы из селективных сред пересевают методом истощающего штриха на три агаризованные дифференциально-диагностические среды—висмут-сульфит агар, среду Плоскирева и среду Эндо (или Левина). В ряде случаев помимо перечисленных сред допускается использование агара с бриллиантовым зеленым и феноловым красным (при анализе мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих). Посевы культивируют при 36(±1)°С в течение 24-48 ч. Предварительный учет производят через 24 ч, окончательный—через 48 ч.

На дифференциально-диагностических средах отмечают наличие колоний, характерных для сальмонелл. При отсутствии в посевах характерных колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продукта.

Если хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде обнаружены колонии, характерные для Salmonella, проводят их дальнейшее изучение.

Выявление бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах

г) Биохимическое подтверждение принадлежности к Salmonella. Не менее трех характерных колоний с каждой дифференциально-диагностической среды пересевают на поверхность скошенного МГ1А и параллельно на трехсахарный агар (штрихом по поверхности и уколом в столбик). Посевы культивируют при 36(±1) °С в течение 24 ч.

После того как произведен посев, из материала отобранных колоний готовят мазки и окрашивают их по Граму. Бактерии рода Salmonella являются не образующими спор грамотрицательными палочками с закругленными концами.

Учет результатов культивирования на трехсахарном агаре позволяет установить способность бактерий к ферментации лактозы, сахарозы и глюкозы, а также способность к образованию сероводорода. В ряде случаев допускается использование сред Ресселя, Клиглера (при анализе яичных продуктов, мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих), Крумвиде-Олькеницкого (при анализе яичных продуктов, мяса, колбасных изделий и продуктов из мяса). Типичные культуры Salmonella ферментируют глюкозу (с образованием или без образования газа), не ферментируют лактозу и сахарозу, образуют сероводород.

Дальнейшим исследованиям подвергают бактерии, удовлетворяющие этим требованиям, а также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа). Эти культуры пересевают на поверхность скошенного МПА и инкубируют при 36(±1)°С в течение 24 ч. Выросшие бактерии используют для определения способности к расщеплению мочевины, образованию индола и ацетоина, ферментации сахарозы и маннита, подвижности.

Выявление бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах

Для установления способности расщеплять мочевину культуру высевают штрихом на среду Кристенсена с мочевиной и культивируют при 36(± 1) °С в течение 24 ч. При росте уреазоположительных бактерий среда достаточно быстро (часто даже после 2 ч инкубации) приобретает цвет от розового до темно-вишневого. Сальмонеллы мочевину не расщепляют.

Для определения образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) культуры пересевают в мясопептонный бульон с глюкозой. Посевы инкубируют при 36(±1) °С в течение 48 ч. Затем отбирают в стерильную пробирку 1 см3 культуральной жидкости, прибавляют 0,6 см3 раствора α-нафтола. Пробирку встряхивают и прибавляют 0,2 см3 раствора гидроокиси калия в концентрации 400 г/дм3. Смесь хорошо встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию. Учет результатов реакции можно проводить не ранее чем через 15 мин и не позднее чем через 2 ч. Сальмонеллы не образуют ацетоина (реакция отрицательная).

Для определения образования индола культуры пересевают в мясопептонный бульон с триптофаном. Посевы инкубируют при 36(±1)°С в течение 24 ч. Затем к посевам прибавляют по 1 см3 реактива Эрлиха или Ковача. При наличии индола (положительная реакция) в пограничном слое в течение 5 мин появляется красное окрашивание. Сальмонеллы индол не образуют.

Для установления способности к ферментации маннита и сахарозы культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой. Посевы культивируют при 36(±1)°С в течение 24 ч. При сбраживании указанных субстратов изменяется цвет среды, образуется или не образуется газ. Сальмонеллы не сбраживают маннит и сахарозу.

Для определения подвижности культуры пересевают уколом в полужидкий МПА. Посевы инкубируют при 36(±1)°С в течение 24 ч. При росте подвижных бактерий наблюдается диффузный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных бактерий—только вдоль места укола. Большинство сальмонелл подвижно.

Полученные результаты оценивают пользуясь таблицей.

Выявление бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах

В ряде случаев (например, при анализе мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих) дополнительно выявляют способность выделенных культур к дезаминированию фенилаланина. Сальмонеллы дают отрицательную реакцию.

д) Серологическое подтверждение принадлежности к Salmonella. Культуры, проявившие типичные биохимические свойства, пересевают на поверхность скошенного МПА и инкубируют при 36(±1) °С в течение 24 ч.

Определение самоагглютинирующих штаммов. Каплю физраствора помещают на предметное стекло и диспергируют в ней часть исследуемой культуры так, чтобы получилась густая гомогенная суспензия. Стекло осторожно покачивают 30-60 с. Затем отмечают результаты на темном фоне (лучше при помощи увеличительного стекла). Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, т. е. образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией. Эти штаммы не подвергают дальнейшей серологической идентификации.

Определение О-антигенов проводят в реакциях с поливалентными сальмонеллезными сыворотками основных групп А, Б, С, Д, Е, а затем, если не выявлено О-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп. Ход определения указан в прилагаемых к сывороткам инструкциях.

е) Оценка результатов. К Salmonella относят культуры, показавшие типичные биохимические и серологические реакции. Предположительно к Salmonella относят культуры с типичными биохимическими реакциями, но не имеющих самоагглютинации и О-антигенов, а также культуры с типичными биохимическими реакциями и самоагглютинацией.

- Читать далее "Выявление и определение количества Staphylococcus aureus в пищевых продуктах"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.10.2019

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.