Методические указания по контролю в рыбных продуктах парагемолитических вибрионов — возбудителей пищевых токсикоинфекций. ГИПРОРЫБФЛОТ 1991.

Инструкция по санитарно -микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных. ГИПРОРЫБФЛОТ 1991.

МУК 4.2.2046-06 Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов в рыбе, нерыбных объектах промысла, продуктах, вырабатываемых из них, воде поверхностных водоемов и других объектах.

а) Определение наличия (присутствия) парагемолитических вибрионов. Навеску продукта массой 25 г помещают в 100 см³ среды обогащения и термостатируют при 37(±1)°С в течение 18-24 ч. Затем полученные культуры пересевают методом истощающего штриха на поверхность среды ДДА. Посевы культивируют в течение 24 ч при температуре 37(±1)°С.

Чашки с посевами просматривают и отмечают наличие характерных для парагемолитических вибрионов колоний: плоско-выпуклые полупрозрачные правильной округлой формы (диаметр 1-5 мм) с ровными краями, имеют влажную гладкую блестящую поверхность, голубовато-зеленоватый цвет на аналогичном фоне среды.

Для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов к парагемолитическим вибрионам отбирают не менее пяти характерных колоний. Из материала отобранных колоний готовят мазки и окрашивают их по Граму. Парагемолитические вибрионы — прямые или слегка изогнутые грамотрицательные палочки (0,8-5,0 мкм), не образующие спор.

Для дальнейшего изучения свойств выделенных культур их пересевают в 1 % пептонную воду с 3 % NaCl и на среду ДДА. Посевы инкубируют 24 ч при 37(± 1) °С. Парагемолитические вибрионы при росте в жидкой среде дают характерное помутнение с образованием нежной голубой пленки.

Для выявления подвижности микроскопируют раздавленную (или висячую) каплю. Можно воспользоваться и другим способом. Односуточную культуру высевают уколом в полужидкий агар (0,25% агара) с 3% NaCl и культивируют 24 ч при 37(±1)°С. При росте подвижных форм наблюдается диффузное помутнение среды, слабоподвижные формы вырастают только по ходу укола. Парагемолитические вибрионы являются активно подвижными микроорганизмами.

Для определения наличия оксидазной активности односуточные культуры высевают на поверхность щелочного (pH 8,0) агара с 3% NaCl и инкубируют в течение 18 ч при 37(±1)°С. Затем на выросшие микроорганизмы наносят каплю оксидазного реактива или культуру помещают на бумагу, смоченную реактивом. При положительной реакции через 1-3 мин наблюдается синее окрашивание. Парагемолитические вибрионы содержат цитохромоксидазу.

Способность использовать лактозу и сахарозу определяют путем посева культуры уколом в столбик и штрихом по скошенной поверхности среды Ресселя или Клиглера, содержащие 3% NaCl. Посевы культивируют в течение 18 ч при 37(±1) °С. Парагемолитические вибрионы сбраживают глюкозу, не ферментируют лактозу и не образуют сероводорода (столбик—желтый, наклонная поверхность столбика — красная, газ и сероводород отсутствуют).

Тест на галофильность проводят высевая культуры в пробирки с 5 см³ 1% пептонной воды (pH 7,8) без NaCl и с 3, 8 и 10% NaCl. Посевы инкубируют 24 ч при 37(±1)°С. Парагемолитические вибрионы хорошо растут в средах, содержащих от 3 до 8 % NaCl, и не растут в средах, не содержащих NaCl или содержащих 10 % NaCl.

Для выявления лизиндекарбоксилазы по 0,1-0,2 см³ односуточной культуры, выращенной на жидкой среде (или по 2 петли агаровой культуры), засевают в две пробирки со средой ДАГВ (в одной пробирке среда ДАГВ с добавлением лизина, в другой—без лизина). После посева в каждую пробирку вносят по 0,5 см³ стерильного вазелинового масла. Посевы культивируют в течение 24 ч при температуре 37(±1) °С. Если имеет место декарбоксилирование лизина, среда приобретает фиолетовый оттенок, при отрицательной реакции среда становится желтой. Парагемолитические вибрионы декарбоксилируют лизин.

Для определения способности к образованию индола петлю односуточной культуры, выращенной на жидкой среде, высевают в пробирку с 5 см³ 1 % пептонной воды с 3% NaCl и 0,03% триптофана. Под пробку вставляют полоски индикаторной бумаги на индол. Посевы инкубируют 24 ч при 37(±1) °С. Парагемолитические вибрионы образуют индол, о чем свидетельствует изменение цвета бумаги.

Для постановки реакции Фогес-Проскауэра (теста на ацетилметилкарбинол) односуточные культуры высевают на бульон Кларка с 3 % NaCl и культивируют в течение 24 ч при температуре 37(±1) °С. Затем поступают как указано в отдельной статье на сайте. Парагемолитические вибрионы не образуют ацетилметилкарбинол (ацетоин).

Для определения интенсивности кислотообразования односуточные культуры высевают на бульон Кларка с 3 % NaCl и культивируют в течение 24-48 ч при температуре 37(±1) °С. При наличии роста прибавляют 3-5 капель 0,02 % раствора метилового красного, пробирку встряхивают и выдерживают 1 ч при 37(±1)°С. При сильном кислотообразовании среда окрашивается в красный цвет, при слабом — в желтый. Парагемолитические вибрионы в 84 % случаев демонстрируют сильное кислотообразование.

Для выявления отношения к различным сахарам односуточные культуры высевают на так называемый пестрый ряд—среды Гисса с 1% углеводов (глюкоза, мальтоза, арабиноза) и 3% NaCl. Пробирки со средами должны быть снабжены поплавками. Посевы инкубируют 18-24 ч при 37(±1)°С. При ферментации углеводов с образованием кислых продуктов цвет среды изменяется, при образовании газа последний собирается в поплавке. Парагемолитические вибрионы ферментируют без образования газа глюкозу, мальтозу и арабинозу.

Для проведения О/Ф теста односуточные культуры высевают уколом на среду Хью-Лейфсона, культивируют в течение 24 ч при температуре 37(±1)°С. На данной среде парагемолитические вибрионы расщепляют глюкозу как в аэробных, так и в анаэробных условиях, при этом первоначальный зеленый цвет среды изменяется на желтый во всем столбике (О/Ф (+/+)).

На основании полученных результатов к парагемолитическим вибрионам относят прямые или слегка изогнутые грамотрицательные палочки, не образующие спор, подвижные, содержащие цитохромоксидазу, хорошо растущие при содержании в среде от 3 до 8% NaCl, декарбоксилирующие лизин, образующие индол, ферментирующие (без образования газа) арабинозу, мальтозу и глюкозу. Важно отметить, что выявления указанных признаков вполне достаточно для идентификации при анализе, целью которого является контроль сырья и рыбных продуктов. С целью клинической диагностики или эпидемиологического расследования используют более широкий набор тестов для идентификации парагемолитических вибрионов.

б) Количественный учет парагемолитических вибрионов. Для определения численности парагемолитических вибрионов в 1 г (1 см³) исследуемого продукта производят посев по 0,2 см³ из первого разведения (10^-1) на пять чашек со средой ДДА, т. е. всего высевают 0,1 г продукта; из второго разведения (10^-2) высевают по 0,1 см³ на две параллельные чашки (т. е. по 0,001 г продукта на каждую чашку); из третьего разведения (10^-3) также высевают по 0,1 см³ на чашку (0,0001 г продукта на чашку). Посевной материал втирают в поверхность среды досуха. Для этого используют стерильные стеклянные шпатели.

Чашки с посевами переворачивают и инкубируют в течение 24 ч при температуре 37(±1)°С. В дальнейшем выявление характерных колоний и подтверждение их принадлежности к парагемолитическим вибрионам проводят как описано в отдельной статье на сайте. Если при подтверждении характерных колоний не менее четырех из выбранных пяти (т. е. не менее 80%) можно отнести к парагемолитическим вибрионам, то все характерные колонии на чашке Петри принадлежат парагемолитическим вибрионам. В остальных случаях количество парагемолитических вибрионов определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Отсутствие вибрионов на всех пяти чашках с посевами из первого разведения позволяет сделать вывод, что в 1 г (1 см³) исследуемого продукта парагемолити-ческие вибрионы отсутствуют или содержатся в количестве менее 10 жизнеспособных клеток.

Отсутствие роста характерных колоний на обеих чашках с посевами из второго разведения, но обнаружение при этом на пяти чашках с посевами из первого разведения 10-50 таких колоний свидетельствует, что в 1 г (1 см³) продукта содержится от 100 до 500 жизнеспособных клеток парагемолитических вибрионов.

Если обнаружено значительное количество вибрионов (>50 КОЕ) при анализе посевов из второго разведения и имеется в наличии более 5-10 колоний на чашках с посевами из третьего разведения, то делают вывод о массивном заражении исследуемого продукта парагемолитическими вибрионами—свыше 5×10⁴ в 1 г (1 см³) продукта.

- Читать далее "Определение промышленной стерильности консервов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.10.2019