Выявление и определение количества Staphylococcus aureus в пищевых продуктах

ГОСТ 10444.2-94 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus.

ГОСТ 7702.2.4.-93 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus.

ГОСТ 30347-97 Молоко и молочные продукты. Методы определения Staphylococcus aureus.

ГОСТ 9958-81 Колбасные изделия и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа.

ГОСТ 30364.2-96 Продукты яичные. Методы микробиологического контроля.

МУК 4.2.762-99 Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы; методы микробиологического контроля готовых изделий с кремом

Выявление и определение количества Staphylococcus aureus в пищевых продуктах можно осуществлять путем посевов в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на агаризованные селективно-диагностические среды.

При анализе жидких высококислотных продуктов pH продукта перед посевом на жидкие среды доводят до 7,0(±0,2). При посеве твердых высококислотных продуктов на жидкие среды pH доводят до 7,0(±0,2) в посевах. Если высевают не исходный продукт, а его разведение, pH доводят в исходном разведении. Для доведения pH используют стерильные растворы гидроокиси натрия и соляной или лимонной кислоты.

а) Выявление S. aureus с предварительным обогащением. Метод предназначен для анализа пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см3 жидкого продукта менее 15 КОЕ S. aureus.

При выявлении наличия (отсутствия) S. aureus в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску (или разведение) засевают в солевой либо сахарный бульон. Если исследуют продукты с большим содержанием NaCl, для посевов используют сахарный бульон, во всех остальных случаях применяют солевой бульон. При этом соотношение между количеством посевного материала и питательной средой должно составлять 1:6 или 1:7 (при анализе молока и молочных продуктов— 1:10, при анализе яичных продуктов—1:9). Посевы культивируют при температуре 36(±1) °С в течение 48 ч.

Затем для подтверждения роста микроорганизмов производят высев на поверхность одной из селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агар, молочносолевой агар, яично-желточно-азидный агар, яично-желточно-солевой агар). Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч.

Посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний. Для подтверждения принадлежности к S. aureus отбирают не менее пяти характерных колоний (если выросло менее пяти характерных колоний, то отбирают все выросшие колонии) и пересевают их на поверхность скошенного МПА. Посевы культивируют при температуре 36(±1)°С в течение 24 ч. В дальнейшем определяют отношение выделенных культур к окраске по Граму, наличие каталазы, способность сбраживать мальтозу и возможность плазмокоагуляции.

Из культур, выросших на МПА, готовят мазки и окрашивают их по Граму. К S. anreus относятся грамположительные неподвижные кокки (диаметр 0,6—1,0 мкм), часто расположенные гроздьями, напоминающими гроздья винограда, или одиночно, парами.

Для выявления способности выделенных микроорганизмов образовывать каталазу из выросших культур отбирают петлей часть микроорганизмов и помещают на чистое предметное стекло. Затем наносят на нее обезжиренной пипеткой каплю 3% раствора перекиси водорода. Если через 30-60 с на стекле появляются пузырьки газа, то считают, что микроорганизмы образуют каталазу. S. aureus образует каталазу.

Определяют способность грамположительных микроорганизмов, образующих каталазу, коагулировать цитратную плазму крови кролика. Можно использовать готовую сухую плазму, руководствуясь инструкцией производителя. Подготовленную плазму крови кролика разливают по пробиркам и вносят в нее по одной петле исследуемых культур. Одну пробирку с разведенной плазмой оставляют незасеянной для контроля. Содержимое пробирок перемешивают и помещают их в термостат на 6 ч при 36(±1) °С. Если коагуляции не произошло, то оставляют пробирки (не встряхивать!) еще на 24 ч при 30(±1) °С. Если и в этом случае плазма не скоагулировала, то культуру относят к коагулазоотрицательным стафилококкам.

Реакцию считают положительной в следующих случаях: образуется плотный сгусток, который не меняет своего положения при переворачивании пробирки (++++); сгусток имеет небольшой отсек (+++); сгусток имеет вид взвешенного мешочка (++). Реакция отрицательна, если в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или тогда, когда в плазме появились отдельные нити (+).

Определение способности к сбраживанию мальтозы позволяет дифференцировать S. aureus (сбраживает мальтозу) от других коагулазоположительных видов— S. intermedius (слабо сбраживает мальтозу), S. hyicus subsp. hyicus (не сбраживает мальтозу). Для этого культуры высевают уколом в столбик среды Гисса с мальтозой. Затем на поверхность среды наслаивают 2-2,5 см голодного агара. Посевы инкубируют при температуре 36(±1)°С в течение 48 ч. О сбраживании мальтозы с образованием кислоты свидетельствует изменение цвета среды.

Если при исследовании характерных колоний были обнаружены грамположительные каталазаположительные кокки, сбраживающие мальтозу, то выявленные микроорганизмы относят к S. aureus.

В дальнейшем, если необходимо определить потенциальную энтеротоксигенностъ выявленного S. aureus, то выявляют термостабильную нуклеазу (посев на МПБ — 24 ч при 36(+1)°С; прогрев выращенных культур на кипящей водяной бане в течение 15 мин, охлаждение и затем посев по 1-2 капли культуры в колодцы (лунки) на среде с ДНК, инкубация при 36(±1)°С и последующий учет результатов через 1,2 и 5 ч). При наличии термостабильной нуклеазы в результате гидролиза ДНК вокруг колодца (лунки) на синем фоне среды появляется ярко-розовая зона. Способность S. aureus образовывать термостабильную нуклеазу подтверждает его энтеротоксигенные свойства.

Обобщают полученные данные и производят окончательный учет результатов. Посевы считают положительными (т. е. S. aureus выявлен в анализируемой навеске продукта), если при подтверждении характерных колоний хотя бы одна из них была отнесена к S. aureus.

Выявление и определение количества Staphylococcus aureus в пищевых продуктах

б) Выявление S. aureus посевом на плотные селективно-диагностические среды. Метод предназначен для анализа пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см3 жидкого продукта более 15 КОЕ S. aureus.

Для выявления наличия (отсутствия) S. aureus в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску (или разведение) в количестве 0,1 или 0,2 см3 наносят на поверхность одной из плотных сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара, яично-желточно-солевого агара) в двух параллельных чашках Петри. При анализе молока и молочных продуктов рекомендуют сеять по 1 см3 в три чашки Петри. Посевной материал немедленно равномерно распределяют по поверхности среды стеклянным шпателем. Засеянные чашки подсушивают, переворачивают и инкубируют при 36(±1)°С в течение 48 ч.

Посевы просматривают выявляя характерные колонии. Подтверждение принадлежности выделенных колоний к S. aureus производят так же, как описано в отдельной статье на сайте.

Посевы считают положительными, если при подтверждении характерных колоний хотя бы в одной из них обнаружен S. aureus.

в) Определение наиболее вероятного числа. Метод предназначен для анализа пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 1500 или в 1 см3 жидкого продукта менее 150 КОЕ S. aureus.

Высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в 10 раз. Каждую навеску и (или) разведение в трехкратной повторности высевают в солевой или сахарный бульон (используют только для продуктов с высоким содержанием NaCl). Соотношение между инокулятом и питательной средой—1:6 или 1:7. Посевы культивируют при температуре 36(± 1) °С в течение 48 ч.

Последующий пересев на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждение характерных колоний проводят как описано в отдельной статье на сайте. Посев считают положительным, если при подтверждении характерных колоний хотя бы одна из них была отнесена к S. aureus. НВЧ S. aureus в 1 г (1 см3) продукта рассчитывают пользуясь таблицей 5.8.

г) Определение количества S. aureus посевом на плотные селективно-диагностические среды. Метод предназначен для анализа пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см3 жидкого продукта более 150 КОЕ S. aureus.

По 0,1 или 0,2 см3 продукта либо его разведения наносят в двух повторностях на поверхность одной из сред—Байрд-Паркер агара, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара, яично-желточно-солевого агара. Посевной материал немедленно равномерно распределяют по поверхности среды стеклянным шпателем. Засеянные чашки переворачивают и инкубируют при 36(±1)°С в течение 48 ч.

В дальнейшем выявляют характерные колонии и подтверждают их принадлежность к S. aureus как описано в отдельной статье на сайте. При подтверждении, что не менее четырех характерных колоний из выбранных пяти (т. е. не менее 80%) можно отнести к S. aureus, считают, что все характерные колонии на чашке Петри принадлежат S. aureus. В остальных случаях количество S. aureus определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Пересчет количества S. aureus на 1 г (см3) продукта осуществляют по формуле:

M = NC/m,

где М—количество микроорганизмов в 1 г (см3) продукта;
N — степень разведения навески;
m — количество инокулята, внесенное для посева в чашку Петри;
С—округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Конечный результат вычисления выражают числом от 1,0 до 9,9х 10n.

- Читать далее "Выявление и определение количества анаэробных микроорганизмов в пищевых продуктах"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.10.2019

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.