Функциональную активность лейкоцитов оценивают по интенсивности фагоцитарного и бактерицидного действия.

а) Фагоцитарная активность заключается в способности лейкоцитов связывать на своей поверхности, поглощать и переваривать микробную тест-культуру или другие объекты (частицы латекса). Она выражается процентным отношением активно фагоцитирующих лейкоцитов (фагоцитов) к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов.

Техника определения. В стерильную центрифужную пробирку вносят 0,2 мл раствора гепарина активностью 5000 Ед/мл, разведенного 1:9 изотоническим раствором натрия хлорида, добавляют 5 мл венозной крови, перемешивают. Центрифугируют 10 мин при 1000-1500 об/мин. Происходит расслоение жидкости на верхний—соломенно-желтый прозрачный слой плазмы, нижний—слой эритроцитов и среднюю серебристую пленку между ними—слой лейкоцитов. Пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром отсасывают вначале слой плазмы, затем очень осторожно снимают средний слой лейкоцитов.

В лунки планшета для иммунологических реакций вносят 50 мкл полученной взвеси лейкоцитов и 50 мкл 0,1% взвеси латексных частиц. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37 °С. По окончании инкубации делают тонкие мазки, высушивают на воздухе, фиксируют 20 мин 96% спиртом и окрашивают по методу Романовского — Гимзы. Мазки просматривают в иммерсионной системе и подсчитывают количество фагоцитов, содержащих не менее 3 частиц латекса. Общее количество посчитанных нейтрофильных лейкоцитов должно быть не менее 100. Производят расчет показателей фагоцитарной активности лейкоцитов.

Она выражается процентом клеток, поглотивших частицы латекса, от общего числа подсчитанных лейкоцитов. Абсолютное число фагоцитов подсчитывают, исходя из абсолютного числа нейтрофилов в 1 мкл крови.

Фагоцитарный индекс (показатель), характеризующий интенсивность фагоцитоза,—это среднее число фагоцитированных объектов (микроорганизмов, частиц латекса и др.), приходящихся на 1 лейкоцит. Его определяют путем деления фагоцитированных объектов на общее количество подсчитанных нейтрофилов.

Например. При просмотре мазка установлено, что 100 лейкоцитов фагоцитировали 350 частиц латекса. Следовательно, фагоцитарный индекс равен 350:100 = 3,5.

Присутствие иммунной сыворотки усиливает активность фагоцитоза, что позволяет судить о состоянии защитных реакций организма. В этом случае говорят об иммунном фагоцитозе, оценку активности которого проводят путем определения опсонического индекса (опсонофагоцитарного индекса), который характеризует влияние опсонинов на процесс фагоцитоза.

б) Опсонический (опсонофагоцитарный) индекс — отношение фагоцитарного индекса иммунной сыворотки к фагоцитарному индексу нормальной сыворотки.

Для его определения необходимо иметь:
— иммунную сыворотку, полученную от больного или иммунизированного;
— сыворотку от практически здорового лица (донора);
— взвесь лейкоцитов, полученную от здорового лица (донора);
— микробную взвесь, содержащую 500 млн микробных тел в 1 мл, по оптическому стандарту мутности.

Техника определения. Берут две пастеровские пипетки, фломастером делают отметки на высоте 1,5-2,0 см от конца капилляра. До этой метки последовательно набирают лейкоциты, затем бактериальную взвесь и сыворотки (в одну пипетку берут иммунную сыворотку, в другую—нормальную). Выдувают содержимое каждого капилляра на отдельное часовое стекло, тщательно перемешивают и каждую смесь набирают в капилляр соответствующей пипетки, запаивают конец и помещают в термостат при 37 °С.

Через 15-20 мин кончики капилляров отламывают и берут по капле смеси для приготовления мазков. Мазки фиксируют жидким фиксатором, окрашивают спиртоводным раствором метиленового синего.

При микроскопии препаратов подсчитывают по 100 нейтрофильных лейкоцитов и количество поглощенных ими микробов.

Опсоно-фагоцитарный индекс равен частному от деления: фагоцитарный индекс иммунной сыворотки фагоцитарный индекс нормальной сыворотки

в) Бактерицидная активность фагоцитов оценивается по интенсивности окислительного взрыва и способности восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ-тест) с образованием в цитоплазме клеток гранул формазана сине-фиолетового цвета.

Техника определения (по С. В. Булава, 2004). В 2 лунки планшета вносят по 50 мкл суспензии лейкоцитов, подготовленных так же, как и для определения фагоцитарной активности лейкоцитов (это тесты обычно ставят одномоментно). В одну из них добавляют 50 мкл 0,1% раствора нитросинего тетразолия (НСТ), а во вторую, для исследования индуцированной активности, — по 25 мкл 0,1% взвеси латексных частиц диаметром 0,8-1,4 мкм и 0,2% раствора НСТ. Смеси перемешивают и инкубируют 30 мин при 37 °С. Затем готовят мазки, высушивают на воздухе, фиксируют этиловым спиртом и окрашивают метиловым зеленым.

В мазках при иммерсионной микроскопии подсчитывают количество лейкоцитов с четкими сине-фиолетовыми гранулами диформазана среди 100 лейкоцитов. Результат выражают в относительных (%) и абсолютных величинах. У здоровых лиц гранулы формазана обнаруживают в 7,2 ±1,2% нейтрофилов. Абсолютное количество НСТ-положительных клеток в 1 мкл крови (кл/мкл) подсчитывают по формуле:

НСТ кл/мкл = (Лц х Нф х НСТ) / 10 000,

где Лц — абсолютное количество лейкоцитов в крови (кл/мкл);
Нф — относительное количество нейтрофилов (%);
НСТ — относительное количество нейтрофилов с гранулами диформазана в цитоплазме (%).

При учете результатов индуцированной латексом бактерицидной активности подсчитывают среди 100 лейкоцитов клетки как с частицами латекса и ганулами диформазана, так и клетки только с гранулами диформазана (А.НСТ-клетки). Результат выражают в относительном (%) и абсолютном (кл/мкл) значениях. Абсолютное количество клеток подсчитывают по формуле:

А.НСТ кл/мкл = (Лц х Нф х А.НСТ) / 10 000,

где Лц — абсолютное количество лейкоцитов в крови (кл/мкл);
Нф — относительное количество нейтрофилов (%);
А.НСТ — относительное количество нейтрофилов с гранулами диформазана в цитоплазме в активированном НСТ-тесте (%).

В присутствии индуктора окислительного взрыва (частицы латекса, бактериальные липополисахариды и др.) все 100% лейкоцитов могут накапливать гранулы формазана. Снижение доли формазанположительных клеток свидетельствует о дефектности кислородзависимого механизма бактерицидной активности нейтрофилов.

- Читать далее "Оценка гуморального иммунитета"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.08.2019