Методика проведения реакции пассивной гемагглютинации (РПГА)

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА/РНГА) основана на способности эритроцитов различных видов животных, птиц и человека (I(0) группы крови) адсорбировать на своей поверхности растворимые антигены бактерий или антитела.

Многие антигены бактерий способны спонтанно (антигены полисахаридной природы) или после предварительной обработки танином, бензидином или глюта-ровым альдегидом (антигены белковой природы) адсорбироваться на эритроцитах.

Такие комплексы называют эритроцитарными антигенными диагностикумами.

Иммуноглобулины также могут использоваться для сенсибилизации эритроцитов. В этом случае получают эритроцитарные антительные диагностикумы.

Участие эритроцитарных диагностикумов в специфических иммунных реакциях антиген—антитело обеспечивает пассивное скучивание и выпадение в осадок эритроцитов.

Реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) применяют с целью:
— обнаружения антител в сыворотке крови путем использования известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
— выявления неизвестного антигена на основе его взаимодействия с известным эритроцитарным антительным диагностикумом.

а) Методика РПГА для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Для постановки реакции необходимы:
— исследуемая инактивированная сыворотка больного (прогретая при 56 °С 30 мин);
— эритроцитарный антигенный диагностикум;
— гомологичная антигену контрольная иммунная сыворотка для РПГА в разведении 1:10;
— изотонический раствор натрия хлорида pH 7,0 ± 0,5;
— 40% раствор формалина;
— 10-50% взвесь несенсибилизированных эритроцитов барана;
— планшеты для иммунологических реакций с 96 круглодонными лунками;
— микропипетки.

Антигенные эритроцитарные диагностикумы представляют собой лиофилизированную в фосфатно-буферном растворе 1-10% взвесь эритроцитов барана, предварительно формалинизированных и сенсибилизированных антигеном микроорганизмов. Консервантом является формалин в конечной концентрации 0,5%. Диагностикумы выпускают в жидком или лиофильно-высушенном виде. В последнем случае они представляют собой аморфную массу, сформированную в таблетки красно-коричневого цвета. Регидратированный препарат готовят путем разведения этих таблеток в 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида и получают 1% рабочую взвесь. Диагностикумы выпускают в комплекте с гомологичной диагностической агглютинирующей сывороткой для РПГА в разведении 1:10 и 10-50% взвесью несенсибилизированных эритроцитов барана. Диагностическую сыворотку разводят в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида и получают 10 мл сыворотки в разведении 1:100.

Взятую от больного на исследование сыворотку крови инактивируют прогреванием в инактиваторе (или на водяной бане) 30 мин при 56 °С. Готовят рабочее разведение сыворотки 1:100. Для этого вносят 0,1 мл цельной сыворотки в пробирку, содержащую 9,0 мл изотонического раствора натрия хлорида с 1 % формалина. Последний получают внесением 40% раствора формалина в 0,9% раствор натрия хлорида в соотношении 1:100. Тщательно перемешивают и используют в реакции.

Иногда в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам сыворотки предварительно обрабатывают 10-50% взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием. Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют через 1 ч инкубации при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.

Эритроцитарный диагностикум используют в рабочем разведении смешивая 1 мл диагностикума и 5 мл изотонического раствора с 1 % формалина.

1. Техника постановки. Реакцию ставят в планшетах для иммунологических исследований. В начале в лунки первого ряда планшета вносят по 0,05 мл изотонического раствора натрия хлорида. Затем в первую лунку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:100, перемешивают. Получают разведение сыворотки 1:200, из этой лунки переносят во вторую 0,05 мл сыворотки. Перемешивают, получают разведение 1:400. Затем 0,05 мл сыворотки из второй лунки переносят в третью. Получают разведение сыворотки 1:800 и т. д., проводя двукратные последовательные разведения сыворотки до уровня удвоенного диагностического титра. Из последней лунки диагностического ряда отбирают 0,05 мл с тем, чтобы объем жидкости был одинаков во всех лунках. После этого к разведенной сыворотке добавляют по 0,05 мл эритроцитарного антигенного диагностикума. Внесение равного объема диагностикума приводит к дополнительному двукратному разведению сыворотки в каждой лунке. Так, в первой лунке разведение становится 1:400, во второй — 1:800, в третьей-1:1600 и т.д.

Ставят 3 контроля:
— контрольная иммунная сыворотка в разведении от 1:100 в объеме 0,05 мл + 0,05 мл 1% взвеси диагностикума (положительный контроль);
— отрицательный контроль—взвесь диагностикума с нормальной сывороткой в таких же дозах;
— отрицательный контроль —0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50 + 0,05 мл 1% взвеси несенсибилизированных эритроцитов.

Планшет закрывают крышкой и выдерживают при 37 °С 2 ч. Проводят предварительный учет результатов. Затем оставляют при комнатной температуре на 20-24 ч и делают окончательное заключение.

2. Учет результатов начинают с контролей. Затем оценивают диагностические реакции по четырехплюсовой системе:

++++ резко положительная реакция; эритроциты покрывают дно лунки в виде перевернутого зонтика с неровными краями;

+++ положительная реакция; эритроциты покрывают дно лунки в виде перевернутого зонтика, в центре которого просматривается небольшое кольцо из эритроцитов, не вступивших в реакцию;

++ положительная реакция; размер перевернутого зонтика небольшой, так как количество скученных эритроцитов невелико; остается значительное количество не склеившихся эритроцитов;

+ отрицательная реакция; эритроциты, не вступившие в агглютинацию, оседают на дно лунки в виде маленького диска (пуговки), вокруг которого незначительный ореол скученных эритроцитов; отрицательная реакция; осадок эритроцитов на дне в виде компактного диска (пуговки).

Титром антител считают разведение сыворотки, в котором РПГА положительна не менее, чем на ++ в самом большом разведении при полном отсутствии гемагглютинации в отрицательных контролях. Однако, так же как и при реакции агглютинации, необходимо проследить за его нарастанием через 10-14 дней.

б) Методика РПГА для обнаружения антигена. Для постановки реакции необходимы:
— исследуемый материал, содержащий антиген;
— эритроцитарный антительный диагностикум;
— изотонический раствор натрия хлорида;
— нормальная сыворотка кролика;
— препараты для постановки контролей (см. ниже);
— планшеты для иммунологических реакций с 96 круглодонными лунками;
— микропипетки.

Диагностикум эритроцитарный антительный выпускают в виде сухой взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных иммуноглобулином сыворотки. Препарат ампулирован и имеет вид таблетки светло-коричневого цвета, легко растворимой в изотоническом растворе натрия хлорида.

Вместе со специфическим препаратом в коробке имеются контрольные препараты:
— ампула с формалинизированными танизированными, но не сенсибилизированными эритроцитами;
— 10-50% взвесь формалинизированных эритроцитов для адсорбции гетерогенных антител;
— взвесь стандартного антигена, гомологичного иммуноглобулинам сыворотки, использованной для сенсибилизации эритроцитов;
— иммунная сыворотка к искомому антигену.

1. Техника постановки. Предварительно из инактивированной нормальной сыворотки кролика в разведении 1:100 готовят раствор для разведения. Для этого в пробирку наливают 9,9 мл изотонического раствора натрия хлорида, к которому добавляют 0,1 мл сыворотки кролика. Этот раствор вносят микропипетками в дозе 0,05 мл в 7 лунок первого ряда планшета для иммунологических реакций. Затем в первую лунку добавляют 0,05 мл искомого антигена в разведении 1:5, получают разведение 1:10. Из этой лунки 0,05 мл переносят во вторую лунку, перемешивают, получают разведение 1:20 и так последовательно делают разведения антигена с шагом 2. Из последней лунки диагностического ряда выливают 0,05 мл раствора, чтобы объем антигена был одинаков во всех лунках. После этого в каждую лунку вносят по 0,05 мл эритроцитарного антителъного диагностикума в концентрации, указанной в наставлении к препарату. Это приводит к дополнительному разведению антигена, и в первой лунке конечное разведение антигена составит 1:20, во второй — 1:40, в третьей— 1:80 и т.д.

Контроли:

— положительный контроль — стандартный известный антиген в рабочем разведении + эритроцитарный антительный диагностикум;

— отрицательный контроль — аналогичный исследуемому материалу субстрат, но заведомо не содержащий антигена + эритроцитарный антительный диагностикум;

— отрицательный контроль — исследуемый материал + десенсибилизированные эритроциты для исключения неспецифического склеивания эритроцитов. При исследовании крови этот контроль может оказаться положительным. В этом случае перед постановкой реакции проводят сорбцию исследуемого образца десенсибилизированными эритроцитами.

2. Учет результатов проводят так же, как и в предыдущем методе. Титром антигена считают дозу, с которой эритроцитарный антительный диагностикум реагирует в реакции гемагглютинации на ++ в самом большом разведении при полном отсутствии гемагглютинации в отрицательном контроле.

в) РПГА для определения классов иммуноглобулинов. РПГА может применяться не только для обнаружения и установления титра антител в сыворотке крови, но и для определения их принадлежности к определенному классу иммуноглобулинов (IgM или IgG). Это бывает важно для выявления внутриутробного инфицирования, установления периода развития или рецидива болезни. Дифференцировка макро (IgM)- и микро (IgG) — глобулинов основана на различиях их свойств. Одним из методов является инактивация крупномолекулярных IgM редуцирующими веществами (цистеином или 2-меркаптоэтанолом). При этом происходит разрыв их дисульфидных связей с образованием неактивных субъединиц. Молекулы же IgG не меняют свою структуру и сохраняют антительную активность. Методика с использванием цистеина для этих целей (по Е. В. Чернохвостовой, 1965) описана ниже.

1. Техника постановки. Навеску цистеина 314 мг растворяют в 10 мл 0,2 М раствора натрия гидроксида. Исследуемую сыворотку разводят ФСБ pH 7,2 в соотношении 1:5 и делят на 2 части, разливая в пробирки. В одну из них добавляют равный объем приготовленного раствора цистеина, в другую—равный объем изотонического раствора натрия хлорида. Пробирки со смесями закрывают резиновыми пробками и выдерживают 18-20 ч в термостате при 37 °С.

После инкубации сыворотки разводят двукратно и используют в РПГА. В одном ряду лунок ставят реакцию с сывороткой, не обработанной цистеином, в другом — с сывороткой, обработанной цистеином.

2. Учет результатов проводят как обычно по 4-плюсовой системе в обоих рядах лунок.

Если титры антител в обоих рядах совпадают, это свидетельствует о том, что антитела сыворотки относятся к классу IgG. Если же они в ряду, где использовалась сыворотка, обработанная цистеином, ниже в 4 раза и более, чем в ряду, где сыворотка не обрабатывалась цистеином, антитела относятся к классу IgM.

Для определения классов антител аналогичным способом может быть использована и РСК.

- Читать далее "Методика проведения реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.