Выявление гуморальных факторов естественной резистентности и специфических антител на конкретный антиген позволяет оценить функциональную активность иммунной системы. С другой стороны, возможность обнаружения специальными методами любого из участников иммунного ответа лежит в основе серодиагностики инфекционных болезней.

а) Определение активности компонентов комплемента микрометодом. Для проведения анализа необходимо иметь:
— гемолитическую сыворотку;
— стандартную взвесь эритроцитов барана, содержащую 109 кл/мл;
— комплект лиофилизированных сывороток крови человека, в которых отсутствуют тестируемые компоненты комплемента — Cl, С2, С3, С4, С5.

Техника постановки (по Г. В. Булава, 2004). В лунки 6 вертикальных рядов (А-Н) 96-луночного планшета для иммунологических реакций вносят по 25 мкл веронал-мединаловый буфер в рабочем разведении. В первую лунку каждого ряда добавляют по 25 мкл исследуемой сыворотки, делают двукратные разведения в вертикальном направлении от А до Н. Получают в каждом из 6 вертикальных рядов следующие разведения:

Ряд 1, лунка А—разведение 1:2; лунка В—1:4; лунка С—1:8; лунка D—1:16; лунка Е—1:32; лунка F—1:64; лунка G—1:128; лунка Н — 1:256.

Аналогично — во всех остальных пяти рядах.

Затем во все лунки от А до Н ряда 1 вносят по 5 мкл разведенной лиофилизированной крови человека для определения компонента С1, в лунки ряда 2—для определения С2, ряда 3—для определения С3 и т.д. В лунки ряда для определения общей активности комплемента вносят по 5 мкл веронал-мединалового буфера в рабочем разведении. После этого во все лунки этих шести рядов добавляют по 20 мкл взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированных гемолитической сывороткой.

Инкубируют 1 ч при 37 °С, затем выдерживают не менее 30 мин в холодильнике для полного оседания эритроцитов. Результаты оценивают визуально по последней лунке, где произошел полный гемолиз эритроцитов. Активность комплемента и его компонентов считается достаточной при наличии гемолиза в разведении 1:16-1:64 — для общей активности комплемента, в разведении 1:32-1:128—для компонентов комплемента.

б) Приготовление взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. Стандартную взвесь эритроцитов барана, содержащую 10⁹кл/мл, готовят из дефибринированной крови барана. После удаления сыворотки эритроциты отмывают 3-кратным центрифугированием по 5 мин при 3000 об/мин холодным рабочим раствором веронал-мединалового буфера (ВМБ). При последнем отмывании эритроцитов надосадочная жидкость должна быть совершенно прозрачной. Ее осторожно отсасывают пипеткой. К 1 объему осадка эритроцитов добавляют 17 объемов ВМБ. Для стандартизации из полученной взвеси эритроцитов отбирают 0,2 мл, добавляют 2,8 мл дистиллированной воды, что вызывает лизис эритроцитов. Определяют оптическую плотность (ОП) полученного лизата при длине волны 541 нм (в кювете толщиной 1 см против воды). Если концентрация гемоглобина по ОП равняется 0,7, то количество эритроцитов в приготовленной взвеси составляет примерно 10⁹ кл/мл.

Если ОП не равняется 0,7, то конечный объем взвеси (Vконечн.) определяют по формуле:

V_{конечн.} = (V_{исходн.} x ОП) / 0,7.

Если ОП больше 0,7, то к исходному объему взвеси добавляют ВМБ до конечного объема, определенного по формуле. Если ОГ1 ниже 0,7, то необходимый объем буфера отсасывают после центрифугирования исходной взвеси.

Гемолитическую сыворотку используют в тройном титре, т.е. разводят рабочим раствором ВМБ так, чтобы ее титр в 3 раза превышал рабочий титр, указанный на этикетке. Например, если на этикетке указан рабочий титр 1:3000, сыворотку необходимо развести до 1:1000.

К 10 мл взвеси отмытых эритроцитов барана в концентрации 10⁹ кл/мл добавляют 10 мл гемолитической сыворотки в тройном титре, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37 °С, периодически перемешивая. Вносят 46,7 мл ВМБ, чтобы концентрация эритроцитов составила 1,5 х 10⁸ кл/мл. В этом случае смесь 0,2 мл сенсибилизированных эритроцитов и 2,8 мл дистиллированной воды должна иметь поглощение 1,0 при длине волны 412 нм.

Сенсибилизированные эритроциты можно хранить в течение 7 суток при температуре 6±2 °С, но перед каждым использованием необходимо их отмывать ВМБ и стандартизовать.

в) Лизоцим и методы его титрования. Лизоцим — один из факторов естественной резистентности организма, обладающий свойством разрушать живые и мертвые клетки микроорганизмов, в основном грамположительных. Он синтезируется макрофагами и лейкоцитами, является низкомолекулярным белком (молекулярная масса 15 тыс.), состоящим из одной полипептидной цепи, содержащей 127-130 аминокислотных остатков. Лизоцим содержится в разных средах макроорганизма: плазме крови, слезной жидкости, слюне, секретах кожи и слизистых оболочек, грудном молоке, желудочном и дуоденальном соке, сперме, экстрактах из органов. Некоторые пищевые продукты (куриные яйца, сок редьки, хрена, репы и др.) содержат этот фермент в больших количествах.

При некоторых инфекционных, онкологических и других болезнях лизоцимная активность жидкостей изменяется, что используют с диагностической целью.

Активность лизоцима определяется его титром — наибольшим разведением, вызывающим лизис тест-культуры Micrococcus lysodeicticus, которая является наиболее чувствительной к этому ферменту. Предложено несколько методик определения титра лизоцима.

1. Определение титра лизоцима в жидкой среде с использованием живой культуры М. lysodeicticus. Для проведения исследования необходимы:
— исследуемый материал, содержащий лизоцим;
— одномиллиардная взвесь бактерий М. lysodeicticus (штамм 2665);
— 0,5% раствор натрия хлорида;
— 5 пробирок в штативе;
— мерные пипетки.

Предварительно готовят взвесь указанной культуры, содержащую 1 млрд, микробных тел в 1 мл 0,5% растворе натрия хлорида. Для этого односуточную культуру бактерий М. lysodeicticus на косом агаре смывают 0,5% изотоническим раствором натрия хлорида. Полученную суспензию стерильно отсасывают в пустую пробирку и стандартизуют по оптическому стандарту мутности.

В 4 пробирки вносят по 0,9 мл 0,5% раствор натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 0,1 мл исследуемого материала, перемешивают и далее путем переноса из предыдущей пробирки в последующую по 0,1 мл получают 10-кратные разведения в первых 4 пробирках от 1:10 до 1:10000. Затем во все пробироки вносят по 0,5 мл стандартизированной взвеси тест-культуры М. lysodeicticus. В 5-ю пробирку вносят 1,0 мл 0,5% раствора натрия хлорида и 0,5 мл тест-культуры (контроль культуры). Содержимое пробирок тщательно перемешивают и инкубируют 3 ч при 37 °С. После инкубации проводят учет результатов по последнему разведению, в котором произошел полный лизис тест-культуры. Более точные результаты получают при измерении оптической плотности микробной взвеси в опытных и контрольной пробирках нефелометрическим или спектрофотометрическим методами. По калибровочным или специальным таблицам можно выразить содержание лизоцима в исследуемом материале в мкг/мл.

Так, установлено, что в сыворотке крови здоровых людей содержится 5-20 мкг/мл лизоцима, в слюне — 50-70 мкг/мл.

2. Определение количества лизоцима методом диффузии в агар Чариоти (в модификации Л. А. Каграмановой) с использованием ацетонового порошка убитой тест-культуры М. lysodeicticus. Ацетоновый порошок названной культуры готовят следующим образом. Приготавливают смыв в 5 мл изотонического раствора натрия хлорида культуры М. lysodeicticus, выращенной на косом 2% МПА. Эту взвесь по 2 мл засевают на поверхность МПА, разлитого в матрацы. Инкубируют в термостате при 37 °С. По истечении срока инкубации выросшую на каждом матрасе культуру смывают 75-100 мл изотонического раствора, фильтруют через 2 слоя марли, центрифугируют на холоде 20 мин при 3000 об/мин, отмывают 2 раза изотоническим раствором и 1 раз дистиллированной водой.

Полученную микробную массу переносят небольшими порциями при постоянном помешивании в 10-кратный объем безводного ацетона, выдерживают 1-2 ч в холодильнике. Затем взвесь микробов в ацетоне после тщательного перемешивания вливают в воронку Бюхнера, на дно которой кладут 2 обеззоленных фильтра, смоченных дистиллированной водой. Микробный остаток на поверхности фильтра промывают 4 раза холодным ацетоном и 2 раза эфиром. Оставшуюся на фильтре микробную массу высушивают на воздухе при комнатной температуре и измельчают в фарфоровой ступке до полной гомогенности. Такая сухая культура в виде мелкого желтовато-серого порошка может храниться длительное время в закрытом резиновой пробкой флаконе.

Применение убитой сухой тест-культуры М. lysodeicticus позволяет стандартизировать условия теста.

Предварительно проверяют приготовленную сухую тест-культуру на лизируемость лизоцимом. Готовят микробную взвесь, содержащую 1 млрд микробных тел в 1 мл, пользуясь стандартом мутности. В две пробирки наливают по 1 мл такой взвеси тест-культуры. В одну из них добавляют 8 мкг лизоцима, растворенного в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида, во 2-ю (контрольную) пробирку — такое же количество изотонического раствора. Пробирки выдерживают при комнатной температуре 30 мин, затем учитывают результаты. Тест-культура считается пригодной для работы, если в опытной пробирке произойдет полный лизис бактерий.

Для определения количества лизоцима в исследуемом материале методом диффузии в агар необходимы:
— исследуемый материал, содержащий лизоцим;
— бифталатный агар;
— ацетоновый порошок убитой тест-культуры;
— раствор калия бифталата, pH 6,2;
— рабочий стандарт коммерческого препарата лизоцима.

Из ацетонового порошка убитой тест-культуры готовят взвесь из расчета на каждые 100 мл среды 150 мг высушенной микробной массы. Эту навеску растирают в фарфоровой ступке с 10 мл раствора бифталата калия, который приливают небольшими порциями. Эту взвесь микробов смешивают с расплавленным и охлажденным до 45 °С фталатным агаром и разливают по 15 мл в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности.

Готовят рабочий стандарт лизоцима. Для этого 10 мг кристаллического лизоцима растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Получают раствор, содержащий 200 мкг лизоцима в 1 мл. Его разливают по 3-4 мл в химически чистые флаконы, закрывают резиновыми пробками, парафинируют и хранят при температуре -20 °С.

Непосредственно перед определением титра лизоцима в исследуемом материале рабочий стандарт лизоцима размораживают, берут 2 мл и разводят 48 мл дистиллированной воды. Получают раствор лизоцима, содержащий 8 мкг в 1 мл, из которого готовят рабочие растворы с содержанием 4, 2 и 1 мкг лизоцима в 1 мл.

В застывшем фталатном агаре, содержащем взвесь тест-культуры, на равном расстоянии друг от друга делают 5 лунок диаметром 6-8 мм каждая. В 3 лунки вносят по 2 капли рабочих растворов, содержащих 1, 2 и 4 мкг лизоцима, а в оставшиеся 2 лунки —исследуемый материал, содержащий лизоцим. Этот материал используют в неразведенном состоянии и в разведении 1:2 (сыворотка крови) или 1:10 (слезная жидкость или другой материал, богатый лизоцимом). Чашки Петри помещают в термостат при 37 °С.

Через 24 ч инкубации проводят учет результатов. Измеряют в 2 направлениях диаметр зон лизиса вокруг лунок с рабочими растворами коммерческого лизоцима. Он составляет в среднем 17 мм для 1 мкг лизоцима, 23 мм—для 2 мкг и 26—для 4 мкг лизоцима. Строят калибровочную кривую, откладывая по оси абцисс диаметр зон лизиса, по оси ординат — количество мкг лизоцима.

По этой калибровочной кривой определяют количество лизоцима в исследуемых субстратах, измеряя диаметр зон лизиса вокруг 4 и 5 лунок.

- Читать далее "Методы серодиагностики инфекционных болезней: реакция агглютинации"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.08.2019