Методика проведения реакции кольцепреципитации

Реакции преципитации характеризуются осаждением антигена-преципитиногена из раствора в виде мелких хлопьев в результате взаимодействия с иммунной сывороткой, содержащей антитела-преципитины. Эту реакцию впервые наблюдал австрийский бактериолог и иммунолог Р. Крауз в 1897 г.

Антиген — преципитиноген используется в виде прозрачного коллоидного раствора. Он является молекулярным продуктом разрушенных клеток микроорганизмов и состоит из частиц ультрамикроскопических размеров. Хорошо растворяется в изотоническом растворе натрия хлорида без помутнения. Таким антигеном может быть полисахарид (гаптен) или бактериальный белок (полный антиген), содержащиеся в экстрактах микробных тел, вытяжках из инфицированных органов, спинномозговой жидкости, гное, моче, мокроте и др. Гаптены-преципитиногены обладают высокой термоустойчивостью (до 100 °С и выше), резистентностью к действию пищеварительных ферментов и процессам гниения. Степень разведения преципитиногена обычно велика — 1:106 и более. Результатом взаимодействия антигена-преципитиногена с антителами-преципитинами в зависимости от типа реакции является выпадение мелкозернистого осадка, образование кольца (иммунного преципитата) или дуг преципитата на границе их контакта.

Реакции преципитации являются в основном качественными методами исследования и характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Их применяют главным образом с целью определения антигена и его природы. Для выявления иммуноглобулинов при диагностике инфекционных болезней реакции преципитации применяют крайне редко.

Обязательным условием, обеспечивающим наибольшую эффективность реакции, является использование высокоактивных и абсолютно прозрачных антигенов и специфических высокотитражных преципитирующих сывороток. Титр преципитирующих сывороток определяют по наибольшему разведению антигена, при котором еще наблюдается формирование хорошо различимого преципитата.

а) Методы приготовления антигенов-преципитиногенов. Преципитиноген в виде экстракта готовят из сухой бактериальной взвеси, которую получают путем троекратной обработки материала ацетоном, а затем эфиром. Навеску, содержащую 40 мг этой взвеси, растворяют в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида, энергично встряхивают в течение 30 мин, выдерживают 24 ч при комнатной температуре и центрифугируют 20 мин при 9000 об/мин. Полученный прозрачный экстракт перед постановкой реакции разводят с шагом 2 до нужного значения, так как в реакциях преципитации титруют антиген, а не сыворотку.

Преципитиноген-гаптен получают из смыва суточной агаровой культуры в 1% растворе уксусной кислоты, содержащего 1 млрд микробных тел в 1 мл, путем кипячения в течение 1-2 ч на водяной бане, последующих фильтраций через ватный фильтр и нейтрализации кислоты насыщенным раствором натрия бикарбоната (Na2CO3) под контролем индикатора. Прозрачный фильтрат титруют до нужных значений.

Для получения «полного» антигена Буавена, представляющего собой комплекс полисахаридов и липоидов микробной клетки, используют смыв суточной агаровой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. Смыв трижды отмывают центрифугированием в этом же растворе, заливают 10-кратным количеством 0,25N раствора трихлоуксусной кислоты и выдерживают в холодильнике 3 ч. Затем центрифугируют и надосадочную жидкость фильтруют. Опалесцирующий фильтрат нейтрализуют насыщенным раствором натрия бикарбоната и диализуют в коллоидных мешочках двое суток в проточной водопроводной воде. Вновь центрифугируют, после чего осаждают ацетоном и обрабатывают спиртом и эфиром. Получают сухой порошок белого цвета, который может храниться долгое время. Перед использованием 1 мг антигена разводят в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида или дистиллированной воды и получают основное разведение 1:1000, из которого готовят все последующие.

Существует несколько модификаций постановки реакций преципитации:

• реакция кольцепреципитации (термоиммунопреципитации), впервые предложеная в 1902 г. Суть ее заключается в том, что при наслаивании антигена на преципитирующую сыворотку в специальных преципитационных пробирках на границе их соприкосновения при положительном результате образуется кольцо помутнения. Примером может служить реакция Асколи, которая используется для выявления сибиреязвенного антигена;

• реакции преципитации в геле. Метод основан на том, что антиген и антитела, имеющие разную дисперстность частиц, встречаясь в агаровом геле, в зоне оптимальных концентраций образуют видимые невооруженным глазом белые линии преципитата. Количество таких линий зависит от состава антигена и антител.

Для приготовления геля используют агар или агарозу в виде 1,5-2,0% раствора в изотоническом растворе натрия хлорида или ФСБ pH 7,2-7,6. Выделяют несколько вариантов и модификаций постановки таких тестов:
1) простая (одиночная) линейная иммунодиффузия по Удену;
2) двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони;
3) простая (одиночная) радиальная иммунодиффузия по Манчини.

б) Реакция кольцепреципитации. Для постановки реакции необходимо иметь:
— антиген — преципитиноген, приготовленный одним из указанных выше методов;
— цельную преципитирующую сыворотку (или в разведении 1:2), гомологичную искомому антигену;
— изотонический раствор натрия хлорида;
— преципитационные пробирки, диаметром 3 мм и высотой 2-3 см, поставленные в штатив;
— пастеровские пипетки с тонко оттянутым капиляром.

Техника постановки реакции и учет результатов. В преципитационную пробирку (или ряд пробирок при использовании разведения антигенов 1:50-1:10 000) вносят при помощи пастеровской пипетки 0,2 мл преципитирующей сыворотки с высоким титром. На нее осторожно наслаивают равное количество исследуемого раствора антигена (или антигена в разных разведениях). В положительном случае через несколько минут на границе соприкосновения реагентов образуется кольцо серовато-белого цвета. Обязательно ставят три контроля:
— нормальная сыворотка животного + исследуемый антиген (отрицательный контроль);
— преципитирующая сыворотка + изотонический раствор натрия хлорида (отрицательный контроль);
— преципитирующая сыворотка + гомологичный ей антиген-преципитиноген (положительный контроль).

- Читать далее "Методика проведения простой (одиночной) линейной иммунодиффузии по Удену (J. Oudin, 1946)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.