Методика проведения реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА)

Специфичность результатов РПГА, поставленных с целью обнаружения антигена в исследуемом материале, следует проверять в реакции торможения пассивной гемагглютинации.

Данная реакция основана на том, что антиген, содержащийся в исследуемом материале, полностью связывается высокотитражной гомологичной стандартной сывороткой, добавленной в разведении 1:10, и не может взаимодействовать с эритроцитарным антительным диагностикумом. Однако в ряде случаев возникает необходимость исключить возможность неспецифических физико-химических взаимодействий между компонентами реакции. Дополнительное внесение гомологичного антигену эритроцитарного антителъного диагностикума не должно сопровождаться склеиванием сенсибилизированных эритроцитов этого диагностикума.

В результате положительной реакции РТПГА образуется компактный осадок эритроцитов в виде диска (пуговки). Если же в исследуемом материале присутствует агент, неспецифически реагирующий с эритроцитами, то он реагирует с добавленным стандартным эритроцитарным антительным диагностикумом, и образуется осадок в виде перевернутого зонтика.

Для постановки реакции используют те же ингредиенты, что и в РПГА. Дополнительно необходимо ввести стандартную иммунную инактивированную сыворотку, гомологичную искомому антигену. Ставят положительный и отрицательные контроли, как и в РПГА.

а) Техника постановки. В 2 ряда лунок по 7 в каждом, разливают по 0,05 мл разводящего раствора. Затем в первые лунки вносят исследуемый материал в таком же объеме и производят титрование, как и при постановке РПГА. Из последней рабочей лунки удаляют 0,05 мл. Получают 2 одинаковых ряда разведений антигенсодержащего материала. Во все лунки первого ряда добавляют по 0,05 мл раствора для разведения.

В параллельные лунки второго ряда вместо раствора для разведения вносят по 0,05 мл стандартной иммунной инактивированной сыворотки, гомологичной искомому антигену, в разведении 1:10.

Планшет закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре. Через 1 ч во все рабочие лунки добавляют по 0,05 мл эритроцитарного антителъного диагностикума.

Затем закрытый крышкой планшет помещают в термостат на 2 ч при 37° С, после чего учитывают результат по наличию или отсутствию осадка эритроцитов в виде пуговки.

б) Учет результатов. Если в материале больного присутствует антиген, гомологичный стандартной иммунной сыворотке, его активность полностью подавляется гомологичной сывороткой, и во втором ряду лунок добавленный эритроцитарный антительный диагностикум образует осадок в виде пуговки—полное торможение гемагглютинации, положительная РТПГА. В этом случае специфичность результатов подтверждена. Если же гемагглютинации будет отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РПГА и РТПГА совпадут, то это свидетельствует о неспецифических взаимодействиях в системе. Во всех лунках будет наблюдаться осадок в виде перевернутого зонтика—отрицательная РТПГА, а первичный результат РПГА признается неспецифическим.

РТПГА может применяться не только для контроля специфичности РПГА, но и для обнаружения антигена (или антитела) и установления его количества в исследуемом материале. В первом случае для постановки реакции необходимо дополнительно к ингредиентам реакции РПГА ввести эритроцитарный антигенный диагностикум, сенсибилизированный антигеном, гомологичным стандартной иммунной сыворотке.

в) Техника постановки. Для обеспечения наибольшей чувствительности РТПГА предварительно определяют титр стандартной иммунной сыворотки по отношению к этому эритроцитарному антигенному диагностикуму в РПГА. Наибольшее разведение сыворотки, в котором регистрируется его агглютинация на 4+, является рабочей концентрацией и принимается равной 1 гемагглютинирующей единице (1 ГЕ). В РТПГА используют 2 ГЕ.

В 7 лунок круглодонного планшета для иммунологических реакций вносят по 0,05 мл раствора для разведения. Затем в первую лунку добавляют 0,05 мл исследуемого материала, содержащего антиген, производят двукратные разведения, как и при постановке РПГА, из последней рабочей лунки удаляют 0,05 мл. После этого в каждую лунку вносят по 2 ГЕ стандартной инактивированной сыворотки, гомологичной антигену. При этом в каждой лунке окажется 1 ГЕ сыворотки.

Ставят положительный и отрицательные контроли, как в РПГА.

Планшет закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре. Через 1 ч во все рабочие лунки добавляют по 0,05 мл эритроцитарного антигенного диа-гностикума. Планшет помещают в термостат на 2 ч при 37 °С, после чего учитывают результат.

г) Учет результатов. Задержка гемагглютинации (ее отсутствие) наблюдаются в том случае, если антиген исследуемого материала вступил в реакцию взаимодействия со стандартной иммунной сывороткой. Титр антигена определяют по последней луночке, в которой отсутствует гемагглютинация. В этом случае результат реакции рассматривается как специфический и подтверждается присутствие антигена, гомологичного антителам стандартной сыворотки. Выраженная гемагглютинация наблюдается там, где отсутствует искомый антиген, так как стандартная иммунная сыворотка реагирует с эритроцитарным антигенным диагностикумом.

Если в параллельном ряду поставить реакцию со стандартным антигеном, гомологичным иммунной сыворотке, в известной концентрации, то можно определить минимальное количество искомого антигена, связывающее 1 ГЕ.

Известны и другие методики постановки РТПГА.

- Читать далее "Методика проведения реакции латекс-агглютинации (РЛА)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.