Методы серодиагностики инфекционных болезней: реакция агглютинации

Методы, используемые для диагностики инфекционных болезней, условно можно разделить на 2 группы:
• прямые методы взаимодействия и визуального определения результатов реакции антиген—антитело. Это реакции агглютинации, преципитации, лизиса и связывания комплемента;
• методы с использованием «свидетелей». Такими «свидетелями» могут быть носители антигена или антитела (РПГА, РТПГА, РЛА) или различные метки одного из участников взаимодействия антиген — антитело (ферментные, флюоресцирующие, радиоизотопные и др.). В зависимости от использованной метки эти тесты называются иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ, РНИФ), радиоиммунологический тест (РИТ) и др.

Прямые реакции взаимодействия антигена с антителом осуществляются в две фазы — специфическую и неспецифическую. Первая специфическая фаза характеризуется взаимодействием антигена и антитела с образованием иммунного комплекса, который визуально не определяется. Этот иммунный комплекс при добавлении изотонического раствора образует аггломераты, которые выпадают в осадок и хорошо различимы визуально — вторая неспецифическая фаза реакции. В зависимости от состояния антигена видимая неспецифическая фаза образования иммунного аггломерата проявляется различно, что обусловливает разнообразие этих реакций.

Реакции агглютинации обусловлены склеиванием целых микробных клеток (агглютиногенов) гомологичными антителами (агглютининами) в присутствии электролитов, что проявляется образованием хорошо видимых хлопьев агглютината, выпадающего в растворе в осадок. Существуют различные модификации постановки реакций агглютинации в зависимости от цели исследования.

Для идентификации чистой культуры микроорганизмов (агглютиногена), выделенной из материала больного, используют реакции агглютинации на стекле или в пробирках (развернутая реакция агглютинации). Антитела для этих реакций (классов IgM или IgG) содержатся в заведомо известных диагностических агглютинирующих сыворотках, полученных путем гипериммунизации кроликов (или других животных) определенными видами бактерий. Они характеризуются высоким уровнем антител и обладают выраженной специфичностью.

Видовые (неадсорбированные) агглютинирующие сыворотки содержат антитела к видовым, типовым (серовариантным) и групповым (общим у близкородственных микроорганизмов) антигенам. Их используют для постановки ускоренной, ориентировочной реакции на стекле (пластинчатая реакция) и развернутой реакции агглютинации (объемная пробирочная реакция агглютинации). Последняя ставится в агглютинационных пробирках с разведением сыворотки в изотоническом растворе натрия хлорида до титра сыворотки, который указан на этикетке препарата.

Титр сыворотки — это наибольшее ее разведение (или наименьшее количество антител), при котором реакция агглютинации будет положительной только с гомологичным антигеном. Например, если титр брюшнотифозной видовой сыворотки равен 1:12 800, это значит, что чистая культура бактерий от больного будет идентифицирована как брюшнотифозная только в том случае, если реакция агглютинации будет положительна именно при разведении сыворотки 1:12 800.

Адсорбированные сыворотки лишены перекрестнореагирующих антител к групповым антигенам и содержат только видовые и (или) серовариантные антитела. Они называются монорецепторными, если содержат только один вид агглютининов. Такие сыворотки получают путем последовательного истощения культурами родственных бактерий (метод адсорбции агглютининов по Кастеллани). Их применяют для постановки пластинчатой реакции агглютинации, которая позволяет точно и быстро определить видовую принадлежность выделенной от больного культуры.

а) Пластинчатая реакция агглютинации (на стекле). Для постановки реакции необходимо иметь:
— известную иммунную сыворотку;
— исследуемую культуру бактерий;
— изотонический раствор натрия хлорида;
— предметные стекла;
— пастеровские пипетки.

На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят пастеровской пипеткой каплю известной иммунной сыворотки в разведении 1:10 или 1:20, рядом — каплю изотонического раствора (для контроля антигена).

Затем в каждую каплю вносят исследуемую бактериальную культуру, тщательно перемешивают до получения гомогенной взвеси бактерий. Реакция протекает при комнатной температуре (стекло можно слегка подогреть над пламенем горелки). Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучивание бактерий в виде зернышек или хлопьев, хорошо заметных при покачивании стекла. Контрольная капля остается равномерно мутной (цв. вкл., рис. 19).

При использовании видовой (неадсорбированной) иммунной сыворотки реакция будет ориентировочной, применение адсорбированных или монорецепторных сывороток дает окончательный ответ при определении вида культуры. Например, для точной идентификации бактерий брюшного тифа в реакции агглютинации на стекле необходимо использовать монорецепторные сыворотки с рецепторами 9, Vi, d, что обусловлено антигенной структурой этой бактерии.

б) Развернутая реакция агглютинации для идентификации выделенного микроорганизма. Для постановки реакции необходимо иметь:
— антиген — выделенную чистую культуру от пациента;
— стандартную видовую (неадсорбированную) агглютинирующую сыворотку;
— изотонический раствор натрия хлорида;
— ряд агглютинационных пробирок в штативе;
— градуированные пипетки 1-5-10 мл;
— пастеровские пипетки.

Вся используемая посуда должна быть тщательно вымыта и высушена, стерилизация не обязательна.

В качестве агглютиногена в этой реакции используют взвесь чистой культуры бактерий в изотоническом растворе натрия хлорида, содержащую в 1 мл 2 млрд, микробных клеток, по оптическому стандарту мутности.

Диагностическая иммунная агглютинирующая видовая сыворотка против известного микроорганизма выпускается в высушенном виде. На этикетке ампулы указаны срок годности и титр сыворотки. Перед использованием ее растворяют в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида и готовят основное рабочее раз-ведение 1:100. Для этого 0,1 мл неразведенной сыворотки из ампулы растворяют в 9,9 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Из рабочего разведения сыворотки готовят последовательные двукратные разведения непосредственно в агглютинационных пробирках. Для этого во все пробирки вносят по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Затем в первую пробирку вносят 1 мл сыворотки в разведении 1:100. Получают разведение 1:200. Из этой пробирки 1 мл переносят во вторую пробирку. Получают разведение 1:400 и т. д. пока не достигнут титра сыворотки, указанного на этикетке. На следующем этапе в пробирки с раститрованной сывороткой вносят по 1-2 капле взвесь чистой культуры бактерий. Для контроля готовят 2 пробирки: одна—контроль антигена, другая — контроль сыворотки.

Контроль антигена содержит 1 мл изотонического раствора и 1-2 капли чистой культуры бактерий. Контроль сыворотки — 1 мл сыворотки в рабочем разведении 1:100. Штатив с пробирками встряхивают и ставят в термостат при температуре 37 °С па 2 ч, после чего производят предварительный учет результатов. Окончательный результат регистрируют после выдерживания в течение 18-20 ч при комнатной температуре.

Методы серодиагностики инфекционных болезней: реакция агглютинации

Учет результатов реакции начинают с просмотра контрольных пробирок невооруженным глазом или лучше с использованием лупы или агглютиноскопа. В них жидкость остается гомогенной: в контроле антигена—слегка мутной, в контроле сыворотки — прозрачной. Только в этом случае начинают регистрацию результатов, используя систему четырех плюсов:
++++ полная агглютинация, которая характеризуется образованием большого осадка, часто в виде перевернутого зонтика, и совершенно прозрачной надосадочной жидкостью;
+++ почти полная агглютинация с большим осадком и почти прозрачной надосадочной жидкостью;
++ слабая агглютинация, осадок небольшой, жидкость над ним непрозрачная;
+ агглютинация едва заметна, осадок очень небольшой, жидкость по степени мутности приближается к контролю антигена;
- отрицательная реакция: по внешнему виду соответствует содержимому пробирки с контролем антигена.

Последнее разведение сыворотки, в котором отмечается положительная реакция агглютинации на 4 или 3 плюса, называется титром сыворотки.

Соответствие между видом микроба и диагностической агглютинирующей сывороткой считается достоверным при совпадении титра сыворотки, установленного в реакции, и титра сыворотки, указанного на этикетке ампулы.

Методы серодиагностики инфекционных болезней: реакция агглютинации
Реакция агглютинации при наблюдении невооруженным глазом:
а — контроль; б — слабая агглютинация; в — полная агглютинация.

в) Развернутая реакция агглютинации для обнаружения антител в сыворотке крови человека. Для обнаружения антител в сыворотке крови больного используют развернутую реакцию агглютинации типа Видаля, которая была впервые предложена французским бактериологом Ж. Ф. И. Видалем в 1896 г. для диагностики брюшного тифа. В качестве антигена в этой реакции используют диагностикум, который содержит взвесь убитых бактерий определенного вида. Можно использовать взвесь живой культуры, содержащую 3 млрд бактерий в 1 мл. Количество антител выражают в титре.

Для постановки реакции необходимо иметь:
— стерильную сыворотку крови в количестве 1-2 мл;
— диагностикум — взвесь корпускулярного инактивированного антигена (целых микробных клеток) в изотоническом растворе натрия хлорида или взвесь живой 18-20-часовой культуры микробов, содержащую 3 млрд бактерий в 1 мл;
— изотонический раствор натрия хлорида;
— посуду, аналогичную таковой в вышеописанной реакции агглютинации.

Сыворотку получают из крови, взятой стерильно путем венепункции в количестве 5-10 мл или из пальца — 1-2 мл. После взятия кровь сразу же ставят в термостат при 37 °С на 1 ч. Образующийся кровяной сгусток отделяют от стенок пастеровской пипеткой, и пробирку помещают в холодильник при температуре 4-10 °С на 18-20 ч. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают пастеровской пипеткой в другую стерильную пробирку. При наличии примеси эритроцитов сыворотку центрифугируют и снова отсасывают.

Из этой сыворотки готовят рабочее разведение 1:50 или 1:100. Для этого в 0,1 мл сыворотки добавляют 4,9 мл (1:50) или 9,9 мл (1:100) изотонического раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. Это рабочее разведение используют для приготовления последовательных двукратных разведений сыворотки до 1:1600 в агглютинационных пробирках. После этого вносят по 1-2 капле диагностикума. Ставят 2 контроля в последних пробирках ряда: контроль антигена (КА), который содержит 1 мл изотонического раствора натрия хлорида и 1-2 капли диагностикума, и контроль сыворотки (КС) — 1 мл исходного разведения сыворотки.

Штатив с пробирками интенсивно встряхивают и помещают в термостат на 2 ч при 37 °С, затем проводят предварительный учет результатов. Окончательный результат регистрируют через 18-20 ч выдерживания при комнатной температуре.

Оценку результатов проводят так же, как описано выше, учитывая наличие осадка (агглютината) из склеившихся бактерий и его характер. Осадок, который образуется в результате склеивания микробных тел при взаимодействии с О-агглютининами, компактный мелкозернистый, оседает на дно в виде компактной кучки (мелкозернистая О-агглютинация). При осторожном встряхивании пробирки осадок превращается в мелкозернистые хлопья.

Крупнохлопчатая Н-агглютинация выявляется при взаимодействии Н-агглютининов со жгутиковыми бактериями. Такой агглютинат приобретает форму опрокинутого зонтика на дне пробирки. При встряхивании он превращается в крупные хлопья, похожие на снежинки.

Обнаружение антител является косвенным свидетельством присутствия антигена в организме в данный период времени. Положительную реакцию могут дать и сыворотки людей, ранее переболевших («анамнестическая» реакция) или вакцинированных («прививочная» реакция). Поэтому диагностически достоверным считается четырехкратное и выше увеличение титров антител при вторичной постановке теста через 7-10 дней (исследование так называемых парных сывороток).

- Читать далее "Методика проведения реакции Кумбса (антиглобулинового теста)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.