ПЦР и выявление антигенов бруцелл (возбудителей бруцеллеза, Brucella)

а) Молекулярно-генетический метод. В настоящее время наиболее распространенным среди генетических методов исследования является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит многократное копирование (амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является маркерным.

Преимуществом данного метода при выявлении возбудителя бруцеллеза является возможность идентификации бруцелл в течение короткого промежутка времени (4-6 ч) по сравнению с культуральными методами исследования и высокая чувствительность (100-1000 микробных клеток бруцелл в пробе). При этом отсутствие перекрестных реакций с ДНК Е. coli, V. cholerae, F. tularensis, Y. enterocolitica 09, Y. pestis EV, S. typhimurium обеспечивает специфичность данного метода диагностики. Указанные параметры позволяют оценить данный метод как наиболее быстрый, специфичный и чувствительный из применяющихся в настоящее время для индикации возбудителя бруцеллеза.

Выявление возбудителя бруцеллеза методом ПЦР возможно в пробах клинического материала (кровь, сыворотка крови, гистологический материал), в объектах внешней среды (вода, почва, смывы), в пищевых продуктах (молоко, кисломолочные продукты). Метод может быть использован для идентификации выделенных культур возбудителя бруцеллеза.

б) Реакции, направленные на выявление антигенов возбудителя бруцеллеза: реакция иммунофлуоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция нейтрализации антител (РНАт).

Реакция иммунофлуоресценции (прямой метод) может быть эффективна при исследовании патологического материала от больных людей и животных, а также из объектов внешней среды. Она позволяет выявлять как живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них специфического антигена. Для обнаружения бруцелл применяют флуоресцирующие бруцеллезные иммуноглобулины.

Препараты для люминесцентной микроскопии при исследовании воды готовят из центрифугата и с мембранных фильтров, цельного молока и сливок — из осадка после центрифугирования, который обезжиривают эфиром в течение 20 мин, мяса — из мясного экстракта или осадка, биопробных животных — из препаратов-отпечатков селезенки, абортированных плодов, экссудатов и органов инфицированных животных и людей — из препаратов-отпечатков, получаемых путем прикладывания предметного стекла к поверхности свежего среза.

Препараты подсушивают на воздухе и фиксируют этиловым спиртом в течение 15-20 мин при температуре 37°С или метиловым спиртом при комнатной температуре в течение 15 мин.

После фиксации препараты обрабатывают бруцеллезными флуоресцирующими иммуноглобулинами. Для гашения неспецифического свечения фона применяют бычий альбумин, меченный родамином, который придает клеткам и другим органическим частицам тусклое оранжево-красное свечение. Бруцеллезные люминесцирующие иммуноглобулины и альбумин разводят до удвоенного рабочего разведения, указанного на этикетке, смешивают в равных объемах и наносят на исследуемый препарат. Последний помещают во влажную камеру (чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне) на 15-20 мин, затем промывают проточной водопроводной водой в течение 10 мин и высушивают на воздухе.

На препарат наносят каплю забуференного глицерина (9 частей глицерина и 1 часть забуференного 0,9%-ного раствора натрия хлорида), покрывают покровным стеклом и исследуют под люминесцентным микроскопом.

При положительном результате на темном или оранжево-красном фоне видны клетки с ярким зеленым свечением по периферии.

Реакция нейтрализации антител (РНАт) основана на нейтрализации антител специфическим антигеном, находящимся в исследуемом материале. При этом специфическая сыворотка лишается способности агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные специфическим антигеном. РНАт применяется для обнаружения бруцеллезного антигена в патологическом материале, пищевых продуктах и объектах внешней среды.

Исследуемый материал перед постановкой реакции обеззараживают путем прогревания при температуре 100°С (в кипящей водяной бане) в течение 10 мин. Жидкости (вода, молоко) прогревают в нативном виде, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2 ч и берут для исследования осадок. Кусочки органов, брынзу и другой материал предварительно измельчают, растирают в ступке с добавлением 9 объемов 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Полученную суспензию прогревают, фильтруют через 2 слоя марли или бумажный фильтр и исследуют фильтрат или же центрифугируют его и берут для реакции супернатант и осадок.

Реакцию ставят в полистироловых пластинах с тщательно вымытыми лунками, чтобы исключить присутствие даже следов антигена. Для постановки реакции нужны те же ингредиенты, что и для РНГА, а также взвесь убитых бруцелл в концентрации 5x10 микробных клеток/мл и бруцеллезная сыворотка с высоким титром гемагглютинирующих антител.

Бруцеллезную сыворотку предварительно титруют в РИГА, определяя ее предельное разведение, дающее реакцию не менее чем на 3+. Это разведение принимают за одну сывороточную гемагглютинирующую единицу (ГЕ). Для РНАт берут разведение сыворотки, соответствующее 4 ГЕ. Например, если 1 ГЕ соответствует разведению 1:25 600 до 4 ГЕ — Е6400. Поскольку в РНАт бруцеллезная сыворотка применяется в объеме 0,25 мл, ее используют в удвоенном титре (титр 1:3200). Реакцию ставят в четырех рядах лунок, первый — опытный (8-10 лунок), остальные — контрольные (6 лунок).

В первом опытном ряду титруют испытуемый материал. Во втором (контроль 1) контролируется возможность неспецифической реакции за счет тканевых антигенов или гетерогенных антител. В третьем ряду (контроль 2) контролируется специфичность PHАт с заведомо бруцеллезным антигеном. В четвертом ряду (контроль 3) проверяется активность бруцеллезной сыворотки.

Если одновременно исследуется несколько проб, то для каждой пробы ставят только первый контроль, а второй и третий ставят для всей партии проб.

В лунки первого, второго и третьего рядов вносят нормальную сыворотку кролика (НКС), разведенную 1:100, — по 0,25 мл, а в четвертый ряд — по 0,5 в каждую лунку, кроме первой лунки. Затем в первые лунки опытного и второго (контроль 1) рядов вносят по 0,25 мл исследуемого материала и титруют. В третий ряд (контроль 2) вносят бруцеллезный антиген (взвесь убитых бруцелл в концентрации 5x108 микробных клеток/мл) в объеме 0,25 мл и также титруют. Во все лунки первого (опытного) и третьего (контроль 2) рядов добавляют по 0,25 мл положительной бруцеллезной сыворотки 4 ГЕ (например, 1:3200).

Во все лунки второго ряда (контроль 1) добавляют 0,25 мл ИКС (1:100). В четвертом ряду (контроль 3) разводят бруцеллезную положительную сыворотку в объеме 0,5 мл, начиная с разведения, которое было использовано в первом (опытном) и третьем (контроль 2) рядах и проверяют соответствие разведения сыворотки 4 ГЕ, которые определены ранее (например, 1:6400).

Пластинки встряхивают и ставят в термостат при температуре 37"С на 2 ч. Затем во все лунки четырех рядов добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2,5%-ной взвеси бруцеллезного эритроцитарного антигенного диагностикума. Пластины встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2-3 ч.

При наличии бруцеллезного антигена в исследуемом материале эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки» или маленького колечка — РНАт положительная. Если в исследуемом материале антиген отсутствует, то специфические антитела, добавленные в реакцию, остаются свободными и склеивают эритроциты — РНАт отрицательная.

За титр РНАт принимают последнее разведение исследуемого материала, которое вызывало полное подавление гемагглютинации. Результат РНАт считается положительным, если подавление гемагглютинации отмечается не менее чем в первых 2-3 лунках.

Иммуноферментный анализ (ИФА) используется для выявления бруцеллезного антигена в объектах внешней среды, пищевых продуктах и биологических объектах, а также для идентификации выделенных культур бруцелл. При постановке ИФА используют иммуноферментную тест-систему для определения бруцеллезного антигена. Техника постановки ИФА описана в наставлении к тест-системе.

- Читать далее "Серологический метод диагностики бруцелл (возбудителей бруцеллеза, Brucella)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.1.2020

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.