Серологический метод включает реакции, выявляющие специфические бруцеллезные антитела: пластинчатую реакцию агглютинации (РА), пробирочную РА (Райта), реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА), антиглобулиновую пробу (реакция Кумбса), иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

а) Пластинчатая РА (реакция Хеддльсона). Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстроте получения результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддльсона и Райта применяют диагностикум бруцеллезный жидкий для РА.

Реакцию ставят на обычном оконном тщательно вымытом обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4x4 см каждый — 5 квадратов по горизонтали. В первый квадрат с левой стороны вписывают номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают испытуемую сыворотку в дозах 0,04; 0,02; 0,01 и 0,03 мл (контроль сыворотки).

К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл диагностикума, к последней дозе сыворотки — 0,03 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Сыворотку осторожно смешивают с диагностикумом палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида к 0,03 мл цельного диагностикума. Стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.

В случае положительной реакции в течение первых минут в каплях сыворотки появляются хлопья (агглютинат) и отмечается просветление жидкости. Максимальный срок наблюдения — 8 мин.

Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации. Контроль антигена (диагностикума) ставят один для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена.

Учет реакции проводят невооруженным глазом:

- 4+ (100% агглютинации) — полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями;

- 3+ (75% агглютинации) — почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями;

- 2+ (50% агглютинации) — незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями;

- 1+ — мутная жидкость с едва заметной зернистостью;

- отрицательный результат — равномерно мутная жидкость.

Для трактовки результатов рекомендуется следующая схема:

- агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки — результат резко положительный;

- агглютинация не менее чем на 2+ во всех дозах сыворотки — результат положительный;

- агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки — результат сомнительный;

- отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки — результат отрицательный.

Для диагностики бруцеллеза имеют значение только положительные результаты реакции агглютинации. При сомнительных или отрицательных результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, когда необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РНГА и ИФА.

б) Пробирочная РА (реакция Райта) является одним из основных методов диагностики бруцеллеза у людей. Наибольшую диагностическую ценность РА представляет при острой и подострой формах заболевания.

Реакцию ставят в пробирках, исследуемую сыворотку разводят 1:25 (0,1 мл цельной сыворотки + 2,4 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида) и титруют в объеме 0,5 мл в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Диагностикум бруцеллезный жидкий для РА разводят 1:10 и добавляют в том лее объеме. Полученную смесь встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 18-20 ч. Учет результатов производят после выдерживания пробирок в течение 2 ч при комнатной температуре.

Параллельно из диагностикума, используемого для постановки пробирочной РА и дополнительно разведенного 1:2, готовят стандарт мутности для учета результатов реакции, который помещают в термостат одновременно с основной реакцией.

Учет проводят путем сравнения опытных пробирок с приготовленным стандартом мутности, что позволяет объективно оценивать получаемые результаты агглютинации.

Диагностическим титром принято считать РА не менее чем на 2+ при разведении сыворотки 1:100 и выше.

Следует иметь в виду, что иногда слабоиоложительные результаты реакции на бруцеллез дают холерный и туляремийный антигены, а также Y. enterocolitica 09. Однако инактивация сыворотки при температуре 56-70°С исключает неспецифические показания РА.

в) Антиглобулиновая проба (реакция Кумбса), выявляющая неполные антитела, используется в диагностике бруцеллеза у людей, особенно при хроническом течении инфекции, когда РА может быть отрицательной или положительной в низких титрах.

Сущность реакции состоит в том, что на первом этапе в реакционной смеси происходит соединение неполных антител — глобулинов с бруцеллезным антигеном. Однако в этой фазе реакция остается невидимой. Для выявления комплекса антиген — антитело проводят второй этап реакции, для чего добавляют антиглобулиновую сыворотку. В случае положительного результата комплекс антиген — антитело выпадает в осадок.

При постановке реакции используют предварительно оттитрованную антиглобулиновую сыворотку против глобулинов человека. Для ее титрования необходимо иметь сыворотку крови человека, заведомо содержащую неполные антитела к бруцеллам в высоком титре. При этом первоначально титруют положительную бруцеллезную сыворотку в пробирочной РА по методике, описанной выше, делая до восьми рядов разведений сыворотки.

После учета РА (через 20 ч) отбирают пробирки, в которых отсутствует агглютинация (в нашем примере — начиная с разведения 1:400), и в каждой из них трехкратно отмывают антиген 0,9%-ным раствором натрия хлорида.

В дальнейшем делают несколько разведений титруемой антиглобулиновой сыворотки (в нашем примере от 1:10 до 1:250) и добавляют по 0,5 мл каждого разведения этой сыворотки в один ряд пробирок с антигеном, полученным после отмывания. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37"С. Результаты учитывают также как РА.

За титр антиглобулиновой сыворотки принимают ее наибольшее разведение (в нашем примере — 1:80, 4-й ряд), которое выявляет неполные антитела в максимальном титре (1:3200). Для реакции Кумбса антиглобулиновая сыворотка применяется в удвоенном титре (1:40).

Исследуемую сыворотку разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида 1:10 и ставят РА. После учета реакции (через 20 ч) отбирают пробирки (не менее грех из первых разведений), в которых зафиксирована слабоположительная реакция (+ или ++). Эти пробирки центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин для осаждения антигена. Супернатант удаляют, к осадку добавляют 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида, тщательно встряхивают и снова центрифугируют; таким образом, осадок отмывают трижды. После последнего центрифугирования к осадку отмытого антигена добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки, оттитрованной специально для реакции Кумбса.

Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч. Реакцию учитывают так же, как и РА.

Контроль антигена: 0,5 мл взвеси антигена в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, подвергшегося отмыванию центрифугированием, и 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки. При учете должно наблюдаться равномерное помутнение.

Для контроля антиглобулиновой сыворотки используют сыворотку, содержащую неполные антитела в известном титре.

Диагностическим титром реакции Кумбса считается агглютинация не менее чем на 2+ в разведении сыворотки 1:50.

г) Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) является специфичным и высоко чувствительным методом выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. Для постановки РНГА используется бруцеллезный эритроцитарный антигенный диагностикум, контрольные (десенсибилизированные) эритроциты, ИКС, бруцеллезная сыворотка.

При постановке реакции макрометодом исследуемую сыворотку разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида 1:25 (0,1 мл сыворотки + 2,4 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида) и инактивируют при температуре 56-60°С в течение 30 мин. Перед исследованием сыворотку адсорбируют 50%-ной взвесью контрольных эритроцитов, для чего к 1,2 мл инактивированной сыворотки добавляют 0,2 мл 50%-ной взвеси эритроцитов, встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Затем смесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 2 мин.

Можно оставить сыворотки с эритроцитами на ночь в холодильнике (+4°С), что исключает этап центрифугирования.

Эритроцитарный диагностикум перед применением разводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида согласно инструкции и получают 2,5%-ную взвесь, которая применяется в реакции. Контрольные (десенсибилизированные) эритроциты также разводят согласно инструкции и полученную 2,5%-ную взвесь используют для контроля сывороток.

Исследуемую сыворотку титруют, используя инактивированную НКС, предварительно разведенную 1:100, начиная с разведения 1:50 до 1:400 в объеме 0,5 мл. В каждую лунку добавляют 0,05 мл подготовленного эритроцитарного диагностикума. Пластинки осторожно встряхивают до полного перемешивания содержимого лунок и оставляют при комнатной температуре. Учет реакции производят через 2-3 ч.

При постановке реакции предусматриваются следующие контроли:

- контроль качества ИКС (1:1000) проводят в двух лунках. К 0,5 мл сыворотки добавляют в первую 0,05 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума, во вторую — 0,05 мл контрольных эритроцитов;

- контроль качества диагностикума осуществляют путем титрования специфической бруцеллезной сыворотки начиная с разведения 1:50 до 1:100 000. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума.

Реакция считается специфической, если контроли исследуемых и контрольной сыворотки в реакции будут соответствовать титру, указанному на этикетке флаконов эритроцитарного диагностикума.

Оценка реакции проводится по следующей схеме:

- 4+ — эритроциты покрывают все дно лунки равномерным слоем, иногда наблюдается зонтик;

- 3+ — эритроциты выстилают все дно лунки тонким равномерным слоем, но площадь его меньше, чем при 4-крестовой реакции, размеры зонтика также меньше;

- 2+ — агглютинат небольшой, расположен в центре лунки;

- 1+ — вокруг осадка эритроцитов в центре виден небольшой агглютинат;

- отрицательная реакция — осадок эритроцитов на дне лунки в виде пуговки или маленького кольца.

За титр сыворотки принимают ее последнее разведение с оценкой реакции не менее чем на 3+. Титр в РИГА у людей 1:50 — реакция сомнительная, 1:100 и выше — положительная.

д) Иммуноферментный анализ (ИФА) используют для диагностики всех форм заболевания, а также при эпидемиологическом обследовании населения и при отборе лиц для вакцинации против бруцеллезной инфекции.

Тест-система представляет собой набор ингредиентов для проведения ИФА на твердофазном носителе и включает в себя бруцеллезный липополисахарид либо планшет, сенсибилизированный этим антигеном, антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой (конъюгат), контрольные (положительная и отрицательная) сыворотки человека, набор солей, необходимый для приготовления буферных растворов, субстрат — ортофенилдиамин, твин-20, бычий сывороточный альбумин, планшеты для ИФА однократного применения. Реакцию ставят в соответствии с прилагаемой к тест-системе «Инструкцией».

Диагностическим титром на бруцеллезную инфекцию в ИФА считается разведение сыворотки более чем 1:400.

Непрямой иммунофлуоресцентный метод (нРИФ). Заранее готовят мазки из двухсуточной агаровой культуры бруцелл (1х10⁹ микробных тел/мл), фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин, высушивают на воздухе и помещают во влажную камеру. На одном предметном стекле делают 8 мазков. Исследуемую сыворотку разводят двукратно с разведения 1:2 до 1:320 и наносят пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом помещают в термостат при температуре 37°С на 30 мин.

Затем мазок отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания докрашивают антивидовой люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении. Дальнейшая обработка препарата ведется как при прямой РИФ.

В качестве контролей служат препараты бруцелл, обработанные бруцеллезной сывороткой (положительный контроль) и сывороткой, не содержащей антитела к бруцеллам (отрицательный контроль).

Реакцию учитывают путем просмотра препарата под люминесцентным микроскопом. Диагностическим считается титр не менее 1:4.

- Читать далее "Аллергологический метод диагностики бруцелл (возбудителей бруцеллеза, Brucella)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.1.2020