Питательные среды, тесты для выделения, культивирования и идентификации бактерий рода Haemophilus

а) «Шоколадно»-кровяной агар (ШКА).

А. ШКА, в том числе для посевов спинномозговой жидкости от больного с подозрением на гнойный менингит.

Состав: 2%-ный питательный агар для менингококка и гемофилов (на основе сердечномозгового бульона, триптических переваров мяса, казеина, с содержанием аминного азота 1,5-1,7 г/л, сухих коммерческих сред АГВ, «Эритрит-агара», Мюллера-Хинтона, Колумбийского агара, GC-агара и др.), содержащий 0,5% глюкозы.

К расплавленному питательному агару добавляют 5% дефибринированной крови барана, лошади, кролика, подогревают в водяной бане при температуре 80°С 5 мин, постоянно помешивая, затем добавляют еще 5% крови и продолжают прогрев при этом же режиме еще 5 мин, после чего остужают до 50"С и разливают в чашки и/или пробирки.

Б. ШКА, пригодный только для гемофилов.

Состав. 2%-ный мясопептонный агар (МПА), pH 7,4-7,6, 10% крови барана или лошади, или 5% эритроцитарной массы крови человека (возможно использование лизированной крови, хранившейся в морозильной камере) и 0,5% дрожжевого экстракта или раствора НАД.

К 100,0 мл охлажденного до 75°С МПА асептически добавляют половину необходимого объема крови (5,0 мл), тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 3-5 мин при температуре 80-90°С, непрерывно помешивая. Остужают при комнатной температуре до 50°С и добавляют вторую половину крови, снова прогревают при 80-90°С в течение 3-5 мин. Смесь остужают до 45-50°С и добавляют в нее дрожжевой экстракт (5,0 мл) или НАД (см. ниже) до конечной концентрации 15 мкг/мл (0,3 мл). Агар тщательно перемешивают, разливают по чашкам и/или пробиркам.

Готовую среду ШКА хранят в холодильнике не более 1 нед.

Для Н.ducreyi раствор НАД в среду можно не добавлять.

б) «Шоколадно»-кровяной бульон (ШКБ). Состав. Мясопептонный бульон с добавлением 10% крови и 0,5% дрожжевого экстракта или НАД до конечной концентрации 15 мкг/мл, pH 7,4-7,6. Последовательность добавления ингредиентов и режим прогрева те же, что и при приготовлении ШКАБ.

в) Двухфазная среда для выделения гемокультур. Твердая фаза — «шоколадно»-кровяной агар, разлитый и скошенный в стерильных флаконах. Жидкая фаза — «шоколадно»-кровяной бульон, асептически добавленный во флаконы с застывшим скошенным ШКА.

г) Селективный агар для выделения гемофилов при смешанной микрофлоре. 500,0 мг бацитрацина растворяют в 50,0 мл стерильной дистиллированной воды. К 100,0 мл приготовленного ШКАб, охлажденного до 45°С, добавляют 3,0 мл раствора бацитрацина. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

д) Среда НТМ для определения чувствительности к антибиотикам. Состав. Агар Мюллера-Хинтона с НАД (15 мкг/мл) и гемином (15 мкг/мл).

После растворения агаровой основы в нее добавляют сухой дрожжевой экстракт до конечной концентрации 5 мг/мл и раствор гемина до конечной концентрации 15 мкг/мл. Для приготовления маточного раствора гемина к 50,0 мг коммерческого препарата гемина добавляют 100,0 мл 0,01N раствора NaOH и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения. Раствор гемина добавляют к агаровой основе из расчета 0,3 мл на 100,0 мл агаровой среды. После автоклавирования и охлаждения на водяной бане до 50°С в агаровую среду асептически вносят маточный раствор НАД (3,0 мл на 1 л агаровой среды) до конечной концентрации 15 мкг/мл.

е) Маточный раствор НАД (никотинамид аденин динуклеотид). 50,0 мг НАД растворяют в 10,0 мл стерильной дистиллированной воды и стерилизуют через мембранный фильтр с размером пор 0,22—0,45 мкм.

ж) Приготовление дрожжевого экстракта (по D.Turk a. J.May). Пекарские дрожжи измельчают и смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:1, доводят pH до 4,5 при помощи гидрохлорида НС1. Прогревают при помешивании в кипящей водяной бане 3 мин. Охлажденную взвесь центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 20-30 мин. Надосадочную жидкость фильтруют сначала через бумажный фильтр, затем через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и добавляют в ШКАБ или в ШКБ до концентрации 0,5%.

з) Определение потребности гемофила в X- и/или V-факторах. Используют полоски или диски, пропитанные X,V- и XV-факторами (BBL, Oxoid и др.), наложенные на поверхность питательного агара без этих факторов, засеянного испытуемой бактериальной суспензией.

и) Выявление продукции орнитин-декарбоксилазы. Используют диски с орнитином (СИБ, Н.-Новгород и др.), которые помещают в пробирку с 0,3-0,5 мл густой суспензии суточной испытуемой агаровой культуры в физиологическом растворе, заливают стерильным вазелиновым маслом и инкубируют 18-24 ч при 37°С. При положительном результате появляется синее или интенсивное зеленое окрашивание.

к) Выявление продукции индола. Испытуемую суточную культуру суспендируют в пробирке с ШКБ, в нее помещают индольную тест-полоску, инкубируют 18-24 ч. При положительной реакции тест-полоска окрашивается в розовый цвет.

л) Определение бета-лактамазы. Используют бумажный диск, пропитанный хромогенным цефалоспорином (ни-троцефином). Перед постановкой теста диск пропитывают каплей дистиллированной воды, после чего на него наносят несколько изолированных колоний испытуемой суточной культуры с ШКА.

Учет реакции производят через 5 мин. При положительной реакции на месте нанесения культуры цвет диска переходит в красный, при отрицательной реакции цвет не изменяется. При проведении этого теста необходима постановка контроля качества с двумя штаммами, дающими положительную (Staphylococcus aureus, АТСС 29213) и отрицательную (Haemophilus influenzae, АТСС 10211) реакции.

- Читать далее "Среды для выделения и культивирования бруцелл"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 2.3.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.